Progettazione e realizzazione di un ECM gel porcino come bioink per costrutti tubolari

The innovative medical and biomedical techniques evolution aims to remedy the so-called “transplant crisis” because the transplanted organs and tissues demand exceeds their availability. Hence the Regenerative Medicine and Tissue Engineering play a huge role in the development of new technologies and new methods to regenerate the injured region by promoting a spontaneous repair process. These new therapies try to overcome two of the most important limits of transplant, i.e. the immunological rejection and the need of immunosuppressive therapy. To this purpose, the thesis seeks the right application of decellularization, freeze-drying, the extracellular matrix solubilization and 3D bioprinting techniques to create a trachea or a coronary artery substitute according to the human anatomical structures. The work starts from the development of a valid decellularization protocol, compliant to the limit parameters required for the tissue decellularization. Then suitable protocols were sought to guarantee the extracellular matrix solubilization, after the dECM (decellularized extracellular matrix) lyophilization. Lastly, the suitable biomaterial ink composition was identified to bioprint the constructs taking care of the correct parameters. Specifically, the thesis is structured as below: starting from Introduction, it provides an overview of the project work with an historical and medical background and defines the main points conducted to reach the final objective. Then Chapter 1 provides the state-of-the-art in order to give a detailed explanation of all topics discussed in the thesis. In particular, the macro-areas considered are: the anatomy, pathology and conventional therapies of the trachea and coronary arteries to provide details about the anatomical structures treated and the related pathologies and conventional approaches; Regenerative Medicine importance, acquired over the years, and the goals that it seeks, with the main technologies developed such as the decellularization and 3D printing methodologies; then explanation of decellularization and the different methods developed; extracellular matrix and description of its major components, important to preserve in decellularization protocols; freeze-drying meaning and steps to obtain a powder; the brief state of the art overview concerning enzymatic digestion of extracellular matrix powder; 3D printing and bioprinting, summarising the different steps and technologies; an overview of the main natural and synthetic bioinks used in the three-dimensional constructs bioprinting; Regenerative Medicine technologies and approaches applied to trachea and coronary arteries developed and being tested in the last years. All materials and methods used in the project are described in Chapter 2. We start with the chosen and modified decellularization protocols in order to process the trachea and aorta: six decellularization protocols were tested. Then the quantitative and qualitative evaluation methods of the decellularization protocols, performed by Dr. Croce, and the externally conducted freeze-drying procedure are briefly described. There is a section dedicated to the dECM enzymatic digestion, in which the three tested solubilization procedures are described. In addition, the gelatin and alginate-based bioinks, proposed for printing, are shown and, finally, all the pre-processing steps, i.e. the three-dimensional structures design with SolidWorks software and their slicing with Cellink software (both for test constructs and final prototypes), and processing steps, i.e. the constructs printing with the Inkredible+ printer (testing the different prepared materials and the different geometries with pre-crosslinking or post-crosslinking with single or many layers) are analysed. Then, Chapter 3 is dedicated to results. The decellularization protocols evaluations, received from the Policlinico di Milano, are described and explained; the freeze-drying, enzymatic digestion and bioink preparation results are reported; the 3D bioprinting results are shown and demonstrated both for the test structures and for the trachea and aorta prototypes with 0.41 mm or 0.58 mm diameter nozzles, with a single layer or with several layers and then also with two extruders. The last attempt was, in fact, the tracheal and aortic printing with 10 layers using two cartridges, containing the same solution but different dyes, in order to reproduce the components of aorta (intima, media, adventitia) and trachea (connective and muscular tissue, fibrocartilaginous ring). The whole project is summarised in the last section with evaluations and conclusions and possible future developments. In fact, starting from the initial idea of designing and producing an ECM (extracellular matrix) porcine gel as a bioink for tubular constructs, the intention is to implement the studies carried out and transfer them to coronary arteries. The qualitative and quantitative analyses could be extended for a complete characterisation of all the procedural steps; the two bioinks composition, loaded in the printing cartridges, could be varied to improve the printability parameters; the cells could be incorporated or post-printing seeded; the constructs could be adequately stimulated by physical and chemical stimuli. If the experiment is carried on, the suitably designed and characterised constructs could be tested in vivo, in animal models, and subsequently, enter in the clinical phase, on humans, achieving a goal in the field of Regenerative Medicine.

Lo sviluppo di diverse tecniche mediche e biomediche mirano spesso a porre rimedio alla cossiddetta “crisi di trapianto” per cui la necessità di organi e tessuti da trapiantare supera notevolmente la disponibilità degli stessi. In tale prospettiva si inserisce la Medicina Rigenerativa e quindi l’Ingegneria dei Tessuti, tramite la ricerca di nuove tecnologie e nuovi metodi volti a rigenerare la regione lesionata favorendo un processo spontaneo di riparazione, superando così due limiti fondamentali del trapianto quali, il rigetto immunologico e la necessità di una terapia immunosoppressiva. In quest’ottica si colloca il presente lavoro di tesi che, ricercando la giusta combinazione di tecniche di decellularizzazione, liofilizzazione, solubilizzazione della matrice extracellulare e di stampa 3D, si pone come obiettivo ultimo la realizzazione di un sostituto tridimensionale di trachea e di arteria coronarica il più possibile conformi alle strutture anatomiche umane. Il progetto è stato sviluppato a partire dalla messa a punto di un valido protocollo di decellularizzazione che soddisfasse i parametri limite necessari affinchè la trachea e l’aorta porcini fossero adeguatamente decellularizzati; gli studi sono stati effettuati su campioni di trachea e aorta di maiale ma l’intento finale è quello di trasferire questi ultimi approfondimenti alle arterie coronariche, vasi arteriosi simili all’aorta ma con dimensioni ridotte. Dopo la liofilizzazione della dECM (matrice extracellulare decellularizzata), sono stati ricercati protocolli idonei a garantire la solubilizzazione della matrice extracellulare; in ultimo è stata individuata la composizione adatta del bioinchiostro per la successiva stampa tridimensionale dei costrutti di interesse con i corretti parametri. Entrando nello specifico, la tesi è strutturata nel seguente modo: a partire dall’Introduzione, essa fornisce una visione generale del progetto di lavoro, contestualizzandolo in ambito storico e sanitario e definisce i punti salienti condotti per raggiungere l’obiettivo finale. All’interno del Capitolo 1 è presentato lo stato dell’arte per permettere una migliore comprensione degli argomenti trattati nella tesi. In particolare le macro-aree considerate sono: anatomia, patologia e terapie convenzionali della trachea e delle arterie coronariche per fornire dettagli sulle strutture anatomiche trattate e le relative problematiche e patologie con gli approcci inetrventistici convenzionali. Nella sezione riguardante la Medicina Rigenerativa, è spiegata l’importanza che ha acquisito nel corso degli anni e gli obiettivi che essa persegue con le principali tecnologie sviluppate, focalizzando l’attenzione sulle metodologie di decellularizazione e stampa 3D; quindi spiegazione della decellularizzazione e dei vari metodi sviluppati; matrice extracellulare e descrizione dei maggiori componenti, importanti da preservare durante la decellularizzazione; significato della liofilizzazione e step previsti per l’ottenimento di una polvere; breve panoramica sullo stato dell’arte riguardante la digestione enzimatica della polvere di matrice extracellulare; stampa e biostampa 3D, elencando i diversi step e le tecnologie in uso; panoramica dei principali bioinks naturali e sintetici, utilizzati nella biostampa dei costrutti tridimensionali; tecnologie e approcci di Medicina Rigenerativa applicati a trachea e arterie coronarie sviluppati e in corso sperimentale negli ultimi anni. Spostandoci nel vivo del lavoro di tesi, all’interno del Capitolo 2 sono descritti tutti i materiali e i metodi impiegati nel progetto. Si inizia con i protocolli di decellularizzazione scelti e adattati per trattare gli organi di interesse, trachea e aorta: in tutto sono stati testati sei protocolli di decellularizzazione. Successivamente sono presentati i metodi di valutazione quantitativa e qualitativa dei protocolli di decellularizzazione, effettuati dal Dr. Croce, e il procedimento di liofilizzazione, condotto esternamente. È presente una sezione dedicata alla digestione enzimatica della dECM, in cui sono state descritte le tre procedure di solubilizzazione provate. Inoltre sono illustrati i bioinchiostri proposti per la stampa, a base di gelatina e alginato, e in ultimo sono analizzati tutti gli step di pre-processing quali, progettazione delle strutture tridimensionali con il software SolidWorks e slicing delle stesse con il software Cellink, sia per i costrutti di prova sia per i prototipi finali, e di processing come la stampa dei costrutti con la stampante Inkredible+, testando i diversi materiali preparati e le diverse geometrie con pre-reticolante o post-reticolante a singoli o molti strati. Il Capitolo 3, invece, è dedicato ai risultati. Sono mostrate e spiegate le valutazioni relative ai protocolli di decellularizzazione ricevute dal Policlinico di Milano; sono riportati i risultati relativi alla liofilizzazione, digestione enzimatica e preparazione dei bioinks; sono mostrati e commentati i risultati della biostampa 3D sia per le strutture di prova sia per le strutture di trachea e aorta con ugelli di 0.58 mm o di 0.41 mm di diametro, a singolo strato o con diversi strati e quindi anche con due estrusori. Il tentativo ultimo è stato, infatti, la stampa di trachea e aorta a 10 strati con ugelli di 22 G utilizzando due cartucce, contenenti la stessa soluzione ma coloranti differenti, per riprodurre le componenti di aorta (tonaca intima, media, avventizia) e di trachea (tessuto connettivo e muscolare, anello fibrocartilagineo). Nell’ultima sezione (Conclusioni) si riassume tutto il progetto effettuato con le relative valutazioni, conclusioni e i possibili sviluppi futuri. Sono stati raggiunti alcuni risultati ancora del tutto preliminari infatti, partendo dall’idea iniziale di progettazione e realizzazione di un ECM (matrice extracellulare) gel porcino come bioink per costrutti tubolari, l’intento è quello di implementare gli studi effettuati e trasferirli alle arterie coronarie. Si potrebbero ampliare le analisi qualitative e quantitative per una completa caratterizzazione di tutti gli step procedurali, si potrebbe variare la composizione dei due bioinks da caricare nelle cartucce di stampa migliorando i parametri di stampabilità e tenendo conto delle differenti componenti che costituiscono trachea e arterie coronarie, si potrebbero incorporare o seminare successivamente le cellule e si potrebbero stimolare adeguatamente i costrutti tramite stimoli fisici e chimici. Proseguendo con la sperimentazione, i costrutti opportunamente realizzati e caratterizzati potrebbero essere testati in vivo, su modelli animali, e successivamente, entrando nella fase clinica, sull’uomo, raggiungendo un buon traguardo nel campo della Medicina Rigenerativa.