Environmental chamber for anaerobic culture

The aim of these project is the development and validation of an experimental set up to allow long term co-cultured of intestinal cells and anaerobic bacteria in a gut on chip model. The set up comprehend an environmental chamber to generate a setting with low oxygen concentration and modified polydimethylsiloxane (PDMS) culture chip provided with optical oxygen sensor to monitor the establishment of different oxygen concentration within separated compartment of the chip. The project is part of a collaboration of Politecnico of Milan with Istituto Europeo di Oncologia (IEO), where experimental validation was performed. Human intestine is colonized by hundreds of species of commensal bacteria, called gut microbiota, most of which are obligate anaerobic as the lumen of intestine, specifically the large intestine, has zero or extremely low oxygen concentration. Gut microbiota has a key role in maintaining intestine homeostasis, it metabolize otherwise indigestible food particles and it affect development of immune system. Alterations of gut microbiota composition are often detected in patients affected by inflammatory bowel diseases in which reduction of commensal bacteria is associated with increase of pathogens. Furthermore, specific microbiota composition was associated with the efficacy of immuno-treatment against several cancer type, highlighting how the lack of particular bacteria species in the intestine of the patients was correlate with negative outcomes of such treatment. Most of our knowledge about gut microbiome is provided by metagenomic studies that can provide information on the composition of bacterial colonies and their function. However, this approach often lack of reproducibility and usually is not able to recapitulate the complexity of the physiological environment.In vivo studies are used to determine mechanistic effect of gut microbiome on animal models but they are subjected to ethical constrains and cannot predict the behavior of human body. Organ on chip (OoC) models are a novel approaches for in vitro studies able to reconstitute key feature of in vivo tissue. Microfluidic devices can simulate organ functional units providing physiological-like stimuli cells to promote their tridimensional organization. Several organ were simulate through OoC technology, including a gut on chip model able to reconstitute the interface between human tissue and anaerobic bacterial community. In order to control oxygen levels in cell cultures, several sensor were implemented in microfluidic system of which oxygen sensitive optical probes are a promising approach. Such sensor are composed by fluorescent dye that change emission intensity in relation to the oxygen concentration and can be embedded in microfluidic devices to be detected by fluorescent microscope. In this project, an environmental chamber able to sustain anerobicity was designed to fit under a fluorescent microscope in order to be used in live imaging experiments. Optimization of a protocol to embed oxygen sensitive particles in a microfluidic chip was carried out together with calibration tests to relate beads fluorescent intensity to oxygen concentration.

Lo scopo di questa tesi è lo sviluppo e la validazione di un sistema sperimentale per permettere una co-cultura a lungo termine di cellule intestinali e batteri anaerobi in un modello microfluidico. Il sistema è composto da una camera ambientale per creare un'atmosfera a basso livello di ossigeno e da un chip microfluidico in polidimetilsilossano che include dei sensori ottici per misurare la concentrazione di ossigeno nei diversi canali del dispositivo. Questo progetto è parte di una collaborazione del Politecnico di Milano con l'Istituto Europeo di Oncologia (IEO). L'intestino umano è colonizzato da centinaia di specie batteriche, chiamate microbiota intestinale, di cui la maggior parte è cosituita da specie anaerobiche perchè il lume di questo organo, specialmente l'intestino crasso, è caratterizzato da una bassa concentrazione di ossigeno. Il microbiota intestinale ha una funzione chiave nel mantenere l'omeostasi dell'intestino, nel metabolizzare cibo altrimenti indigeribile e nello sviluppo del sistema immunitario. Alterazioni nella composizione di questa colonia batterica sono spesso associate a malattie croniche intestinali, nelle quali alterazioni vi è una riduzione di batteri commensali e un incremento di patogeni. Composizioni specifiche di microbiota intestinali sono state correlate all'efficenza di trattamenti immunitari contro diversi tipi di cancro, in particolare l'assenza di specifiche specie batteriche è associata al fallimento di tali trattamenti nel ridurre l'espansione tumorale. Molte delle nostre conoscenze sul microbioma intestinale derivano da studi metagenomici che forniscono informazioni riguardo la composizione di tali colonie batteriche e su alcune loro funzioni specifiche. Questo approccio però manca di riproducibilità tra diversi centri di ricerca e non è in grado di fornire informazioni riguardo i meccanismi di interazione tra il corpo umano e il microbioma. Studi in vivo sono utilizzati per scoprire gli effetti del microbioma sul loro ospite in modelli animali ma tale approccio è limitato da problemi etici e non è in grado di predirre tali effetti sul corpo umano. Modelli organ on chip sono una nuova tecnologia usata per studi in vitro in grado di simulare aspetti chiave dei tessuti in vivo. I dispositivi microfluidici possono fornire alle cellule stimoli come succede nei tessuti fisiologici per ricreare le unità funzionali di vari organi. Diversi modelli di organi sono stati ricreati in dispositivi microfluidici, incluso un modello d'intestino per ricreare l'interazione tra tessuto umano e batteri anaerobici. Per mantenere il livello d'ossigeno sotto controllo in sistemi di coltura cellulare diversi metodi sono stati implementati in dispositivi microfluidici. Tra questi metodi, l'utilizzo di sensori ottici in tali dispositivi possiede diversi vantaggi. Questi sensori sono costituiti da coloranti fluorescenti che cambiano intensità in proporzione alla concentrazione di ossigeno nell'ambiente in cui sono immersi e che possono essere letti da un microscopio a fluorescenza. Questo progetto ha previsto lo sviluppo e la validazione di una camera in grado di sostenere un ambiente senza ossigeno che possa essere posizionata sotto un microscopio per poter eseguire esperimenti biologici in chip durante l'acquisizione di immagini. Per poter misurare la concentrazione di ossigeno durante l'esperimento biologico è stato realizzato e ottimizzato un protocollo per poter includere particelle fluorescenti sensibili all'ossigeno nel chip e insieme alla loro calibrazione avvenuta all'interno della camera anaerobica.