Misure dirette e indirette della pemeabilità nella cartilagine articolare

The following thesis work focuses on the field of Tissue Characterisation. Specifically, we focused on the study of the mechanical parameter of permeability in human articular cartilage. Starting from a previous thesis work, which had been developed simultaneously on two soft tissues (cartilage and cornea), a new set-up was developed in order to improve the reliability of the results. The first change was in the experimental set-up of the Darcy direct test, where the pressure pump was replaced by a pressure chamber. Also from the point of view of the number of samples analysed, being able to concentrate on a single tissue, it was possible to analyse data from enough patients to be able to perform robust statistical tests. Cartilage is a connective tissue, characterised by specific cells called chondrocytes, embedded in an abundant extracellular matrix. Its mechanical properties depend for the most part on the interaction between water, the main element distinguishing these types of tissues, and its interaction with the molecules of the ECM: collagen, proteoglycans, elastin and hyaluronans. Because of its typical composition, porous and made up of two phases, cartilage is one of the tissues that follow biphasic models. The study of cartilage has always stimulated the interest of Regenerative Medicine; as this thin tissue is innervated and avascularised, it is difficult, if not in an infantile phase, for it to regenerate itself. On the other hand, precisely because of these properties, it is not possible to act promptly in the event of damage. The patient begins to feel discomfort when the cartilage structure is already compromised and the two joints come into direct contact. Its role, similar to a bearing, is essential in optimising the distribution of all loads, especially impulsive loads. Permeability is one of these important mechanical characteristics. It is defined as the ease with which a fluid passes through a porous medium. The literature shows that its value is very low: it oscillates in the order of 10-15-10-16 m4/Ns, in healthy cartilaginous tissues. Its properties allow the fluid retained within the tissue to bear most of the load while preserving the extracellular matrix and ensuring adequate lubrication of the synovial fluid. In the following work, 9 femoral heads from 9 different patients were analysed, for a total of 76 cartilage samples sufficiently intact to be subjected to permeability tests. The first method we tested was the confined compression test in displacement control. The decision to reverse the tests, starting with the indirect test, was made to avoid tissue damage and subsequent swelling due to the long time spent in the Darcy direct permeability chamber. In our case, the stress-relaxation test involves 6 ramps, except for samples whose small diameters did not allow a direct test to be carried out at a later date. For the latter, it was decided to speed up the calculation by imposing 4 ramps. From the test, the aggregate modulus HA and the permeability value kcc were obtained by interpolating the experimental curve with the analytical solution proposed by the biphasic linear model of Mow (1980). The average HA also made it possible to derive for each sample the link between the deformation levels and the pressures (Δε= Δp/ 2HA); these values were then kept in memory and reused in the Darcy test. The set-up used for the direct test involves a chamber for the sample, another hermetic chamber for the liquid, which is sent under pressure by means of a piston placed above it, a pressure transducer and software that enables the signals to be processed instantaneously. The program developed with LabView allows us to manage the electronic instrumentation such as the DAQ acquisition card in an intuitive way. Once the pressure had been set using the pressure chamber and the piston, we proceeded to check, using a stopwatch, the time required for the fluid to cross the cartilage disc and channel itself into the graduated capillary. Before each test, care must be taken to fix the sample inside its chamber. This very delicate process requires attention and time. If it is not glued correctly, water will circumnavigate the sample, increasing the outflow and leading to an overestimation of the calculated flow rate. In the opposite case, where an excessive amount of attack is used, the pores of the fabric may become occluded, restricting the correct passage of fluid. The parameters of set pressure, flow rate, and relative thickness of the sample are manually recorded in an Excel file to allow the user, at the end of the test, to calculate the permeability. Each sample was tested at 5 different pressures, which was considered sufficient for a reliable study of the development of the direct permeability coefficient kDarcy. The results of both tests were then plotted in a single graph to facilitate comparison of the curves. Both the results obtained show an exponential decreasing trend. On the other hand, an unexpected and evidently erroneous fact is the average value of kcc, which is two orders of magnitude higher than kDarcy. The reason for this is due to intrinsic errors in the indirect test, which will be analysed in the following chapters. At the end of the permeability tests, each sample was subjected to biochemical analysis at the Istituto Ortopedico Galeazzi, from which the proteoglycan (GAG) content was obtained. The normalised amount of GAG/DNA was then correlated, using a Spearman's statistical test, with the corresponding values of permeability and aggregate modulus measured experimentally. Influencing factors such as age, gender, degree of osteoarthritis, area and depth were also investigated. To do this, an Anova test was used, which unfortunately, unlike the correlation, did not lead to the expected results. In future work, other factors, in addition to those listed, could be researched, which could give a positive match with both permeability coefficients from the direct and indirect test. In particular, for the Confined Compression test, it is evident that it is necessary to revisit the set-up or, in any case, the need to hypothesise new expedients, which in addition to giving a theoretical explanation of the gap between the permeability values, bring concrete modifications to the indirect method.

Il seguente lavoro di Tesi volge il suo interesse nel ramo della Caratterizzazione dei Tessuti. Nello specifico ci si è concentrati sullo studio del parametro meccanico della permeabilità nella cartilagine articolare umana. Partendo da un lavoro di tesi precedente, che si era sviluppato simultaneamente su due tessuti molli (cartilagine e cornea), si è sviluppato un nuovo set-up al fine di migliorarne l’affidabilità dei risultati. La prima modifica la osserviamo nel set-up sperimentale della prova diretta di Darcy, dove la pompa a pressione è stata sostituita con una camera a pressione. Anche dal punto di vista di numero di campioni analizzati, potendosi concentrare su un unico tessuto, si sono potuti analizzare dati di sufficienti pazienti per poter eseguire test statistici solidi. La cartilagine è un tessuto connettivo, caratterizzato da cellule specifiche chiamate condrociti, immerse in abbondante matrice extracellulare. Le sue proprietà meccaniche dipendono per la maggior parte dall’interazione tra acqua, l’elemento principale che distingue questi tipi di tessuti, e la sua interazione con le molecole dell’ECM: collagene, proteoglicani, elastina e ialuronani. Per questa sua tipica composizione, porosa e costituita da due fasi, la cartilagine, rientra nei tessuti che seguono i modelli bifasici. Il suo studio da sempre stimola l’interesse della Medicina Rigenerativa; essendo questo sottile tessuto, innervato e avascolarizzato è difficile, se non in fase infantile, che si rigeneri autonomamente. D‘altra parte proprio per queste sue proprietà, non è possibile agire tempestivamente in caso di danneggiamento. Il paziente infatti inizia a sentire fastidio, nel momento in cui la struttura della cartilagine è già compromessa e le due articolazioni entrano in contatto diretto. Il suo ruolo, assimilabile ad un cuscinetto, è essenziale nell’ottimizzazione della distribuzione di tutti i carichi, soprattutto quelli impulsivi. La permeabilità rientra tra queste importanti caratteristiche meccaniche. Essa è definita come la facilità con cui un fluido attraversa un mezzo poroso. Dalla letteratura si evince che il suo valore è molto basso: oscilla nell’ordine dei 10-15-10-16 m4/Ns, nei tessuti cartilaginei sani. Le sue proprietà permettono al liquido trattenuto all’interno del tessuto, di sopportare la maggior parte del carico preservando la matrice extracellulare e garantendo un’adeguata lubrificazione del liquido sinoviale. Nel seguente lavoro si sono analizzate 9 teste femorali, provenienti da 9 diversi pazienti, per un totale di 76 campioni di cartilagine sufficientemente integri per poter essere sottoposti ai test di permeabilità. Il primo metodo che abbiamo sperimentato è la prova di compressione confinata in controllo di spostamento. La decisione di invertire le prove, partendo da quella indiretta, è stata presa per evitare un danneggiamento del tessuto e il suo conseguente rigonfiamento dovuto al lungo tempo passato nella camera per la permeabilità diretta di Darcy. La prova di stress-relaxation prevede nel nostro caso 6 rampe, tranne per i campioni i cui diametri ridotti non permettevano di eseguire a posteriore una prova diretta. Per quest’ultimi si è scelto di velocizzare il calcolo imponendo 4 rampe. Dal test si sono ricavati il modulo aggregato HA e il valore di permeabilità kcc mediante l’interpolazione della curva sperimentale con la soluzione analitica proposta dal modello lineare bifasico di Mow (1980). L’HA medio ha inoltre permesso di ricavare per ogni campione il legame che lega i livelli di deformazione alle pressioni (Δε= Δp/ 2HA); valori che poi sono stati tenuti in memoria e riutilizzati nella prova di Darcy. Il set-up utilizzato per la prova diretta, prevede una camera di alloggiamento per il campione, un'altra ermetica per il liquido, mandato in pressione attraverso un pistone posto sopra di essa, da un trasduttore di pressione e da un software che permette di rielaborare i segnali in maniera istantanea. Il programma sviluppato con LabView, ci consente di gestire in maniera intuitiva la strumentazione elettronica come la scheda di acquisizione DAQ. Una volta impostata la pressione tramite la camera pressoria e il pistone, si è proceduto a verificare tramite cronometro il tempo necessario a fluido per attraversare il disco di cartilagine e incanalarsi nel capillare graduato. Prima di ogni prova bisogna curare con attenzione il fissaggio del campione all’interno della sua camera. Questo processo molto delicato richiede attenzione e tempo. Se non incollato correttamente, l’acqua circumnavigherà il campione, aumentando il flusso in uscita e portando ad una sovrastima della portata calcolata. Nel caso opposto, in cui venisse usato un eccessivo quantitativo di attack, i pori del tessuto potrebbero occludersi, limitando il corretto passaggio di fluido. I parametri di pressione impostata, la portata, e lo spessore relativo al campione, vengono registrati manualmente su un file Excel per permettere all’utente, alla fine della prova, di calcolare la permeabilità. Ogni campione è stato testato a 5 pressioni diverse, ritenute sufficienti per uno studio affidabile sull’andamento del coefficiente di permeabilità diretta kDarcy. I risultati di entrambe le prove sono stati poi plottati in unico grafico per facilitare il confronto delle curve. entrambi i risultati ottenuti seguono, come ci si aspettava, un andamento esponenziale decrescente. Fatto invece inaspettato ed evidentemente erroneo, è il valore medio di kcc, che risulta essere di due ordini di grandezza maggiore rispetto al kDarcy. La motivazione è riconducibile ad errori intrinseci nella prova indiretta che saranno analizzati nei seguenti capitoli. Al termine dei test di permeabilità, ogni campione è stato sottoposto ad analisi biochimiche presso l’Istituto Ortopedico Galeazzi, dalle quali è stato ricavato il contenuto di proteoglicani (GAG). La quantità normalizzata di GAG/DNA è stata poi messa in correlazione, con un test statistico di Spearman, con i corrispettivi valori di permeabilità e di modulo aggregato misurati sperimentalmente. A fine lavoro si sono studiati anche fattori d‘influenza come: età, genere, grado di osteoartrosi, zona e profondità. Per fare ciò si è utilizzato un’Anova test, il quale sfortunatamente, a differenza della correlazione, non ha portato ai risultati aspettati. In un lavoro futuro si potrebbero ricercare altri fattori, oltre quelli elencati, che possano dare un riscontro positivo con entrambi i coefficienti di permeabilità ricavati dalla prova diretta e indiretta. In particolare per la prova di Compressione Confinata, risulta evidente la necessità di rivisitare il set-up o comunque il bisogno di nuovi accorgimenti, che oltre a dare una spiegazione teorica sul divario tra i valori di permeabilità, apportino modifiche concrete al metodo indiretto.