Biomolecule-friendly grafting-from atom transfer polymerisations to control the molecular architecture of protein-polymer conjugates

The impact of therapeutic proteins in healthcare is steadily increasing, due to advancements in the field of biotechnology and a considerable understanding of several pathologies. However, the safety and efficacy of their administration is often limited by poor pharmacokinetics, short circulation half-life, denaturation and immunogenicity. The conjugation of biocompatible polymers to proteins represents a successful strategy for overcoming these limitations. In this thesis work, a site-specific protein modification by Activator ReGenerated by Electron Transfer (ARGET) Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) was investigated to obtain proteins conjugated with hydrophilic biocompatible polymers of predetermined molecular weight and topology. The main goal was to develop a synthetic platform to generate a new class of protein-polymer conjugates, for half-life extension of biotherapeutics. The novelty lies in the investigation of poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA) as PEG alternative for half-life extension, as well as in the synthesis of a library of new multifunctional ATRP initiators to obtain PGMA and PEG brushes with linear or two-arm architectures, aiming to investigate the effect of polymer composition, molecular weight and topology on protein activity and stability. A biologically friendly approach was firstly developed for the synthesis of PGMA through aqueous ARGET ATRP, under organic solvent-free conditions which are well tolerated by active proteins. Secondly, PGMA of different length and architecture (linear and two-arm) was compared with poly(poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (PPEGMA) for the synthesis of lysozyme-polymer conjugates. Mono- and two- arm functional ATRP initiators were designed and selectively attached to lysozyme at N-terminus, via reductive amination. The enzymatic activity and stability in serum and trypsin showed a clear dependence on the type of repeating unit and on the macromolecular architecture, confirming the potential of PGMA as a PEG alternative for half-life extension of biotherapeutics. Finally, the aqueous ARGET ATRP of GMA was extended to the synthesis of polymeric sacrificial initiators, drug-polymer conjugates and engineered surfaces of carbon nanotubes. Preliminary results showed the versatility of this approach for biomedical application.

L'impatto delle proteine terapeutiche in ambito biomedico è in costante aumento, a causa dei progressi nel campo della biotecnologia e di una notevole comprensione dei processi biologici in diverse patologie. Tuttavia, la sicurezza e l'efficacia della loro somministrazione sono spesso limitate da scarsa farmacocinetica, breve emivita nei vasi sanguigni, denaturazione e immunogenicità. La coniugazione di polimeri biocompatibili con proteine rappresenta una strategia vincente per superare questi limiti. In questo lavoro di tesi, è stata studiata una modifica proteica sito-specifica mediante Activator ReGenerated by Electron Transfer (ARGET) Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) per ottenere proteine coniugate con polimeri idrofili biocompatibili di peso molecolare e topologia diversi. L'obiettivo principale è stato sviluppare una piattaforma sintetica per generare una nuova classe di coniugati proteico-polimero, per l'estensione dell'emivita delle proteine terapeutiche. La novità consiste nello studio del poli(glicerolo monometacrilato) (PGMA) come alternativa al PEG per l'estensione dell'emivita, nonché nella sintesi di una libreria di nuovi iniziatori ATRP multifunzionali per ottenere PGMA lineari e PEG con struttura a spazzola con architetture a uno o a due bracci, con l'obiettivo di studiare l'effetto della composizione del polimero, del peso molecolare e della topologia sull'attività e stabilità delle proteine. Un approccio fortemente biocompatibile è stato inizialmente sviluppato per la sintesi di PGMA attraverso ARGET ATRP in ambiente acquoso, in condizioni prive di solventi organici ben tollerate dalle proteine. In secondo luogo, PGMA di diversa lunghezza e architettura (lineare e a due bracci) è stato confrontato con poli(poli(etilenglicole)metiletere metacrilato) (PPEGMA) per la sintesi di coniugati lisozima-polimero. Sono stati progettati iniziatori ATRP funzionali a braccio singolo e a due bracci e coniugati selettivamente al lisozima all'N-terminale, tramite amminazione riduttiva. L'attività enzimatica e la stabilità nel siero e nella tripsina hanno mostrato una chiara dipendenza dal tipo di unità ripetitiva e dall'architettura macromolecolare, confermando il potenziale del PGMA come alternativa al PEG per l'estensione dell'emivita dei bioterapici. Infine, l'ARGET ATRP acquoso di GMA è stato esteso alla sintesi di iniziatori sacrificali polimerici, coniugati farmaco-polimero e superfici ingegnerizzate di nanotubi di carbonio. I risultati preliminari hanno mostrato la versatilità di questo approccio per l'applicazione biomedica.