Development of a high density continuous perfusion bioreactor unit for the production of polyhydroxyalkanoates using Cupravidius necator

Plastic pollution is one of the most important unresolved challenges worldwide. Although the necessity of a direction change toward a more green and sustainable economy is increasingly gaining ground, the petroleum-based plastic industry is still continuously growing due to the high plastic demands required in a wide range of applications. A possible solution to this problem is replacing petroleum-based plastics with bio-based biodegradable plastics leading to significantly lower carbon emissions and energy production requirements together with a reduction in overall plastic pollution. There are the eco-friendly polymers, but PolyHydroxyAlkanoates (PHAs) seem to be very promising alternatives to petroleum-based plastics due to their thermo-mechanical properties able to satisfy the market need. They are a family of more than 100 different types of thermoplastic biodegradable linear polyesters produced through metabolic pathways of microorganisms such as Cupravidius Necator, a class of aerobic bacteria. However, high production costs due to a nonoptimized production chain make PHAs not sufficiently appealing for commercialization on an industrial scale. This work focused attention on finding a stable bioreactor configuration to maximize PHA productivity coupled with research on the possible effects of substrate concentration on Cupravidius Necator growth kinetics and PHA production. In the end, a functional mathematical model was made to predict Cupravidius Necator behaviour to pave the way for a possible industrial scale-up. During this master thesis project, an optimization using an automated antifoam stream addition was implemented allowing the registration and incrementation in the average lifetime of a perfusion reactor (PR) of 157.51% after bleed activation x without negative side-effects on bacterial growth and overall process parameters such as purity, recovery, productivity and PHA molecular weight. Moreover, discontinuous bioreactor set up such as fed-batch and high-density fed-batch were compared with continuous bioreactor configurations such as PRs and a two-stage cascade bioreactor system confirming that continuous perfusion bioprocesses are the most efficient method for a consistent PHA production which result in higher productivity and recovery. Nevertheless, the effects of ammonia concentration as a limiting substrate were explored demonstrating that in continuous PR, productivity could increase by 66.7% in the presence of substrate limitation. In addition to this, a two-stage cascade of PRs was implemented to enable the separation of growth phase and PHA accumulation. Finally, a functional mathematical model was implemented for the in silico description of the kinetic parameters of bacteria in continuous perfusion bioreactor set ups.

L’inquinamento dovuto alla plastica è una delle più importanti sfide attualmente irrisolte. Nonostante stia prendendo sempre più piede la necessità di un cambio di rotta verso un’economia più verde e sostenibile, l’industria basata su plastiche di origine petrolifera è un settore in continua crescita a seguito dell’elevata richiesta di materie plastiche nei più disparati ambiti di applicazione. Una possibile soluzione al problema sarebbe il rimpiazzo delle plastiche derivanti dal petrolio con plastiche biologiche e biodegradabili portando non solo a una significativa riduzione delle emissioni di carbono e dell’energia richiesta in fase di produzione, ma anche a una riduzione dell’inquinamento in generale. Molti sono i possibili polimeri eco-friendly, ma i Poliidrossialcanoati (PHAs) sembrano essere una promettente alternativa alle plastiche derivanti dal petrolio viste le loro proprietà termomeccaniche capaci di soddisfare l’esigenza del Mercato. Sono una famiglia di più di 100 differenti tipologie di poliesteri termoplastici biodegradabili prodotti attraverso vie metaboliche di microorganismi come i Cupravidius Necator, una specie di batteri aerobici. Nonostante questo, gli alti costi di produzione dovuti a una catena produttiva non ottimizzata non rendono i PHAs sufficientemente appetibili per una commercializzazione su scala industriale. Questo lavoro focalizza l’attenzione sul trovare una stabile configurazione di set up per bioreattori al fine di massimizzare la produttività e, al contempo, di far luce sui possibili effetti che diverse concentrazioni di substrato possono avere sia sulla cinetica di crescita dei Cupravidius Necator sia sulla produzione di PHAs. Infine, è stato prodotto un funzionale modello matematico per predire il comportamento dei Cupravidius Necator al fine di aprire la strada per un possibile scale-up industriale futuro. xiii Durante questo progetto di tesi magistrale, è stata compiuta un’ottimizzazione impiegando una via automatica di inserimento per una soluzione di antischiuma permettendo di segnare un incremento nella vita media dei bioreattori a perfusione (PR) del 157.51% dopo l’attivazione del bleed senza effetti secondari negativi sulla crescita batterica o sui parametri generali di processo come purezza, recovery e produttività oltre che peso molecolare dei PHAs. In aggiunta a questo, bioreattori in modalità discontinua come fed-batch e high-density fed-batch sono stati comparanti ai bioreattori in modalità continua come i PRs insieme a un sistema a cascata di due bioreattori in continua. Da ciò, è stato possibile confermare come i processi biologici in perfusione continua sono la via più efficace per una produzione consistente di PHAs grazie alla loro elevata produttività e recovery complessiva. Inoltre, gli effetti della concentrazione di ammoniaca, visto come substrato limitante, sono stati esplorati per dimostrare come la produttività dei PRs in modalità continua possa aumentare del 66.7% se si è in presenza di condizioni di limitazione di substrato. In aggiunta a questo, un sistema di due PR in continua disposti in serie è stato implementato per poter garantire la separazione tra la fase di crescita batterica e la fase di accumulo di PHA. Infine, un modello matematico funzionale è stato implementato per una descrizione in silico dei parametri cinetici di crescita batterica in un bioreattore a perfusione continua.