Hybrid DNA-gold nanostructures for biosensing

In the course of this thesis, the synthesis, characterization, and optical analysis of hybrid nanostructures made of two gold nanospheres and dynamic DNA origamis were carried out, in order to develop novel biosensors. Gold nanospheres feature excellent optical and physicochemical properties that make them suitable for applications in biosensing. In addition to having good colloidal stability and excellent biocompatibility, they exhibit strong light-matter interactions and plasmonic resonances in the visible range. Moreover, the nanoscale distance between two nanospheres provides near-field electromagnetic plasmonic coupling, associated with an enhancement of the effective scattering cross-section and a red-shift of the resonance wavelength. Measuring the change in the resonance wavelength allows the detection, with nanometer-scale resolution, of the change in the interparticle spacing. The biosensors under investigation in this thesis aim to associate the presence of a specific stimulus with a change of the interparticle spacing of a dimer of gold nanospheres. At the single-nanostructure level, the response to the stimulus is translated into a change of color of the nanostructure in a darkfield microscope: the signal can be easily detected performing confocal scattering spectroscopy with a spectrometer or simply with a color camera. To translate the presence of a biochemical stimulus in a modification of the interparticle spacing, structural DNA nanotechnology is exploited, in particular DNA origamis. A DNA origami is a synthetic complex structure of interconnected DNA strands that can be programmed to respond to different external stimuli with dynamic morphological modifications. In this thesis, a protocol for the synthesis and the assembly of hybrid nanostructures made of a dimer of gold nanospheres with a diameter of 42 nm has been optimized, with each nanosphere assembled on an arm of a Y-shaped DNA origami. To regulate the distance between the arms of the Y-shaped origami, a recognition site, where the interaction with the analyte takes place, is placed between them. The versatility of DNA-based nanotechnology allows the design of different conformations for the recognition site depending on the stimulus to be detected: optical responses were observed for variations of ionic strength and to the presence of specific DNA strands, interacting either by hybridization or by strand displacement reactions. This work showed the easily detectable optical response to stimuli and the excellent stability of these DNA-gold hybrid nanostructures, paving the way for their application as biosensors at the single-molecule level.

Nel corso di questa tesi è stata effettuata la sintesi, la caratterizzazione e l'analisi ottica di nanostrutture ibride composte da due nanosfere d'oro e un origami dinamico di DNA, al fine di sviluppare nuovi biosensori. Le nanosfere d'oro possiedono importanti proprietà ottiche e fisico-chimiche che le rendono adatte ad applicazioni nel campo dei biosensori. Oltre ad avere una buona stabilità colloidale e un'eccellente biocompatibilità, interagiscono fortemente con la luce e presentano risonanza plasmonica nel visibile. Inoltre, dalla vicinanza di due nanosfere nasce l'accoppiamento plasmonico, il quale si manifesta con un aumento della sezione d'urto efficace e una variazione della lunghezza d'onda di risonanza verso il rosso. Misurare il cambiamento della lunghezza d'onda di risonanza permette di rilevare, con una risoluzione nanometrica, il cambiamento della spaziatura tra le nanosfere d’oro. I biosensori oggetto di questo studio mirano ad associare la presenza di uno specifico stimolo ad una riduzione della spaziatura tra le nanosfere d’oro di un dimero. A livello della singola nanostruttura, la risposta allo stimolo si traduce in un cambiamento del colore della stessa in un microscopio in campo oscuro: il segnale può essere facilmente rilevato eseguendo una spettroscopia confocale di diffusione con uno spettrometro o semplicemente con una camera CCD a colori. Per tradurre la presenza di uno stimolo biochimico in una modifica della spaziatura tra le nanosfere d’oro, sono state sfruttate tecnologie strutturali basate sull’utilizzo di DNA, in particolare, i DNA origami. Un origami di DNA è una struttura sintetica complessa, composta da filamenti di DNA interconnessi, che può essere programmata per rispondere a diversi stimoli esterni con modificazioni morfologiche reversibili. In questa tesi, è stato ottimizzato un protocollo per la sintesi e l'assemblaggio di nanostrutture ibride costituite da un dimero di nanosfere d'oro con un diametro di 42 nm, ciascuna montata su un braccio di un DNA origami a forma di Y. Per regolare la distanza tra le braccia della Y, un sito di riconoscimento, dove avviene l'interazione con l'analita, è posto tra di esse. La versatilità delle tecnologie basate sull’uso del DNA ha permesso di progettare diverse configurazioni di siti di riconoscimento in base allo stimolo che si vuole rilevare: sono state osservate risposte ottiche per variazioni di forza ionica e alla presenza di specifici filamenti di DNA, interagenti sia per ibridazione che per reazioni di strand displacement. Questo lavoro ha mostrato che queste nanostrutture ibride oro-DNA presentano una grande stabilità in soluzione e una risposta ottica agli stimoli facilmente rilevabile, aprendo loro la strada a potenziali applicazioni come biosensori di singola molecola.