FRET imaging of microglial TNF-alpha dependent CamKII-alpha activity in living neurons

Microglia are dynamic and ramified cells of the CNS ensuring a constant surveillance of their environment. They are motile and their surface contains a wide range of receptors whose majority is for neurotransmitters. Both these aspects allow them to sense and interact with neuronal activity in a dynamic crosstalk. Microglia are the immune resident cells of the CNS and they produce a large repertoire of cytokines, which can exert a variety of functions. Tumor Necrosis Factor (TNFα), which is one of the main cytokines produced by microglia, is an example of this broadly ranging activity.  It can induce cell death but also it can promote synaptic plasticity. For instance, TNFα is known to control synaptic scaling; a homeostatic behavior of glutamate receptors at synapses. Recent works done at IBENS by Maria Pinto have demonstrated that synaptic plasticity of inhibitory synapses was dependent on microglial TNFα (Microglial TNFα controls GABAAR plasticity and slow waves during sleep submitted). Furthermore, this form of plasticity called “inhibitory Long Term Potentiation” (iLTP) was shown to be dependent on Ca2+/Calmodulin dependent protein kinase II (CamKIIα), a cardinal mediator of synaptic plasticity. More precisely, iLTP depend on the phosphorylation of this kinase at the Threonine 286 site. During iLTP, CamKIIα get phosphorylated and relocalizes at inhibitory synapses to promote enrichment of GABAAR which strengthen the synapse. Maria Pinto has also shown that during iLTP, this particular phosphorylation was microglial TNFα dependent. More than placing TNFα regulation as a central mechanism in neuronal plasticity, these results raise the question of the mechanism by which this regulation takes place. The high motility of microglia and the high dynamism of CamKIIα suggest precise and local interactions. Thus, we expect a specific temporality and spatiality of this regulation. These considerations were the starting point of this work: evaluate the dynamic regulation of CamKIIα by microglial TNFα and by microglia in a more general approach. To temporally and spatially assess CamKIIα activity, we chose a FRET (Forster Resonance Energy Transfer) live imaging technique. FRET is a mechanism describing energy transfer between 2 fluorescent molecules. A donor fluorophore, initially excited may transfer energy to an acceptor fluorophore that can excite this latter, if both fluorophores are close enough. Because CamKIIα changes of conformation upon activation, FRET can be used to detect activation of the kinase if the donor and the acceptor fluorophores are both flanked on the protein. For this work, we chose CamuiCR, a FRET based sensor of CamKIIα activity developed by Lam et al. First, we generated a pipeline to express, visualize and analyze FRET signals of CamuiCR in primary cortical neurons. We developed a ratiometric analysis of CamuiCR FRET signals and we validated that CamuiCR was a reliable FRET based sensor of CamKIIα activity. Then, we studied TNFα regulation of CamKIIα activity by stimulation or neutralization of different TNFα signaling pathways. We modulated the forward and the reverse signaling of TNFα but also applied EVs and showed that they changed CamKIIα activity. Finally, we optimized this analysis for Brain Organotypic Slices (BOS) where the visualization of an acceptable FRET signal in dendrites was the main challenge. We showed that we could image CamuiCR signals in BOS under a spinning disk microscope. In parallel, we developed a perfusion system to keep the BOS in good health along the recordings. We finally showed that we were able to modulate and assess CamKIIα activity by FRET ratiometric analysis in BOS. The results of this work are the basis for a future in-depth analysis of CamKIIα regulation in living neurons in relation with neuronal activity, microglial dynamic and TNFα secretions. The high acquisition speed of the spinning disk and the high resolution provided by the confocal technology allow for a live screening of CamKIIα activity. This is a considerable step in terms of activity imaging in 3D living structures like BOS.

Le microglia sono cellule dinamiche e ramificate del sistema nervoso centrale (SNC) che assicurano una sorveglianza costante del loro ambiente. Sono mobili e la loro superficie contiene una vasta gamma di recettori per la maggior parte destinati ai neurotrasmettitori.  Questi due aspetti permettono alle cellule microgliali di percepire e interagire con l'attività neuronale in un crosstalk dinamico. Le microglia sono le cellule immunitarie residenti del SNC e producono un ampio repertorio di citochine, che possono esercitare una varietà di funzioni. Il fattore di necrosi tumorale (TNF-alfa), che è una delle principali citochine prodotte dalla cellula microgliale, è un esempio di questa grande diversità di attività.  Il fattore TNF-alfa può indurre la morte cellulare, ma può anche promuovere la plasticità sinaptica. Per esempio, il TNF-alfa è noto per controllare la "synaptic scaling"; un comportamento omeostatico dei recettori del glutammato alle sinapsi. Ricerche recenti condotte presso l'IBENS da Maria Pinto hanno dimostrato che la plasticità sinaptica delle sinapsi inibitorie è dipendente dal TNF-alfa microgliale (Microglial TNFα controls GABAAR plasticity and slow waves during sleep submitted paper). Inoltre, questa forma di plasticità chiamata potenziamento inibitorio a lungo termine "inhibitory Long Term Potentiation (iLTP)", dipende dalla Ca2+/Calmodulina dipendente dalla protein chinasi II (CamKIIα), un mediatore centrale della plasticità sinaptica. Più precisamente l’iLTP dipende dalla fosforilazione della chinasi alla treonina 286. Durante l'iLTP, la molecola CamKII-alpha viene fosforilata alla treonina 286 e si rilocalizza alle sinapsi inibitorie per promuovere l'arricchimento del GABAAR che rafforza la sinapsi. Maria Pinto ha anche dimostrato che questa fosforilazione particolare è dipendente di microgliale TNFα. Più che porre la regolazione del TNFα come un meccanismo centrale nella plasticità neuronale, questi risultati sollevano la questione del meccanismo con cui questa regolazione ha luogo. L'alta motilità della microglia e l'alto dinamismo di CamKIIα suggeriscono interazioni precise e locali. Così, ci aspettiamo una specifica temporalità e spazialità di questa regolazione. Queste considerazioni sono state il punto di partenza di questo lavoro: valutare la regolazione dinamica di CamKIIα dal TNFα microgliale e dalla microglia in un approccio più generale. Per valutare temporalmente e spazialmente l'attività di CamKII, abbiamo scelto la tecnica di live imaging FRET (Forster Resonance Energy Transfer). FRET è un meccanismo che descrive il trasferimento di energia tra 2 molecole fluorescenti. Un fluoroforo donatore, inizialmente eccitato può trasferire energia a un fluoroforo accettore che può eccitare quest'ultimo, se entrambi i fluorofori sono abbastanza vicini. Poiché CamKIIα cambia conformazione al momento dell'attivazione, FRET può essere usato per rilevare l'attivazione della chinasi se i fluorofori donatore e accettore sono entrambi affiancati sulla proteina. Nel presente lavoro di tesi, abbiamo scelto CamuiCR, un sensore FRET dell'attività di CamKIIα sviluppato da Lam et al. In primo luogo, abbiamo generato una pipeline per esprimere, visualizzare e analizzare i segnali FRET di CamuiCR in neuroni corticali primari. Abbiamo sviluppato un'analisi raziometrica dei segnali FRET di CamuiCR e abbiamo dimostrato che CamuiCR era un affidabile sensore FRET dell'attività di CamKIIα. Poi, abbiamo studiato la regolazione dell'attività di CamKIIα mediate da TNFα attraverso la stimolazione o la neutralizzazione di diverse vie di segnalazione del TNFα. Abbiamo modulato la segnalazione in avanti e quella inversa di TNFα, ma abbiamo anche applicato Vescicole Extracellulare (EVs) e abbiamo dimostrato che hanno cambiato l'attività di CamKIIα. Infine, abbiamo ottimizzato questa analisi per Brain Organotypic Slices (BOS) dove la visualizzazione di un segnale FRET accettabile nelle cellule dendritiche è stata la problematica principale. . Abbiamo dimostrato che potremmo immagine CamuiCR segnali in BOS sotto un microscopio a disco rotante. In parallelo, abbiamo sviluppato un sistema di perfusione per mantenere il BOS in buona salute lungo le registrazioni. Infine, abbiamo potuto anche modulare e valutare l'attività di CamKII-alfa mediante analisi raziometrica FRET in BOS. I risultati di questo lavoro sono la base per una futura analisi più approfondita della regolazione di CamKII-alfa nei neuroni viventi in relazione all'attività neuronale, alla dinamica microgliale e alle secrezioni di TNFα. L'alta velocità di acquisizione del disco rotante e l'alta risoluzione fornita dalla tecnologia confocale permettono uno screening dal vivo dell'attività di CamKIIα. Questo è un passo importante nella visualizzazione di immagini che consentano la valutazione dell'attività in strutture viventi 3D come le BOS.