Implementation and application of an interferometric scattering microscopy setup in combination with conventional and total internal reflection microscopy

An iSCAT setup in combination with conventional fluorescence imaging has been designed, developed and characterized. The microscope has the potential to investigate in a non invasive manner biological samples with high frame rate and localization precision through Interferometric Scattering (iSCAT) microscopy with a large, homogeneously illuminated Field of View (FoV) while allowing simultaneous fluorescence imaging. This multi-channel microscope is shown to be able to perform iSCAT imaging of a 25x27µm region of interest with a frame rate of 3000fps where a particle can be localized with a precision of ≈ 20nm, also thanks to the homogeneous FoV. Moreover it is shown that it is able to perform conventional fluorescence imaging both in epi and Total Internal Reflection (TIR) configuration. In Chapter 1, a theoretical introduction to the two imaging techniques used is given and the physics phenomena they rely on are explained. The main applications in Life Sciences are highlighted and first perspective about the combination of the two techniques is given. In Chapter 2, the custom optical setup development is described and all the optical elements used are analyzed. The optical path is divided in illumination and imaging path in order to have a more clear and organic view of the set up. The choices made and the acceptable trade-offs in the design are addressed. In Chapter 3, the microscope is characterized based on four parameters: the Field of View (FoV), the Point Spread Function (PSF) estimation, the localization precision and the Signal to Noise Ratio (SNR) of the detection equipment. The characterization is performed using different type of optical hardware to find the optimal combination. Moreover a proof of concept of correlative iSCAT and Fluorescence imaging is given. Finally, in Chapter 4, conclusions are summed up and future developments are discussed alongside future application of the setup in the fields of Life Sciences .

Un setup iSCAT in combinazione con un canale convenzionale di fluorescenza è stato disegnato, costruito e caratterizzato. E’ stato dimostrato come il microscopio è capace di investigare in maniera non invasiva campioni biologici con un’ alta velocità di acquisizione e precisione di localizzazione attraverso un microscopio ad Interferometric Scattering (iSCAT) con un FoV ampio ed omogeneo, mentre è anche possibile acquisire immagini in fluorescenza. Questo microscopio multi canale si è mostrato in grado di acquisire immagini iSCAT di una regione 25x27µm con una velocità di acquisizione di 3000fps e una precisione di localizzazione di ≈ 20nm grazie anche an un FoV omogeneo. Inoltre, è mostrato come il canale di fluorescenza sia in grado di acquisire immagini sia in configurazione epi che Total Internal Reflection (TIR). Nel primo capitolo, le due tecniche utilizzate sono analizzate da un punto di vista teorico e i fenomeni fisici sul quale si basano sono esposti. Le principali applicazioni nel campo delle Life Sciences sono menzionate e una prima prospettiva sull’ utilizzo combinato dei due canali è messa in luce. Nel secondo capitolo, lo sviluppo del setup in ogni suo elemento ottico è spiegato. Il cammino ottico dei due canali è diviso in cammino di illuminazione e cammino di acquisizione in moda da avere una visione completa e organica delle scelte fatte. Nel terzo capitolo, il microscopio è stato caratterizzato basandosi su quattro parametri: il Field of View (FoV), la stima della Point Spread Function (PSF), la precisione di localizzazione e il rapporto segnale-rumore (SNR). La caratterizzazione è stata fatta utilizzando componenti diversi in modo tale da trovare la combinazione ottimale per le performance del microscopio. Inoltre un test preliminare di acquisizione correlata fra i due canali è presentato. Infine, nel quarto capitolo, le conclusioni finali sono riassunte e i futuri miglioramenti sono discussi insieme alle future applicazioni del setup nelle Life Sciences.