Study of fusogenic peptides as gene delivery vectors using in silico and in vitro approaches

Now more than ever, due to the advent of COVID-19 pandemic and the development of vaccines exploiting non-viral vectors’ features, the attention towards non-viral gene delivery has increased. In this context, peptide-based carriers represent a novel alternative to viral vectors for gene expression and gene silencing purposes, thanks to their tunable characteristics and great biocompatibility. In particular, this thesis work focused on the study of four fusogenic peptide sequences (GALA, KALA, RALA, HALA2) whose features were fully investigated through in silico and in vitro approaches. Computationally, peptides’ secondary structure and complexation ability were evaluated by means of All-Atoms, Metadynamics and Coarse-Grained Molecular Dynamics simulations. On the other hand, peptides were fully synthesized and characterized exploiting Circular Dichroism and Tryptophane Fluorescence Spectroscopy analysis. Moreover, in vitro complexation ability was assessed through SYBR Green I Exclusion assay and Circular Dichroism spectroscopy. At last, transfection experiments were conducted to evaluate gene expression in HeLa cells. In terms of peptides’ characterization, results from in silico simulations and in vitro experiments were compared, highlighting the reliability of most of the computational methods. In vitro complexation ability assessment was found impractical using SYBR Green I fluorescent dye, but some qualitative information were extrapolated through Circular Dichroism analysis. However, complexation ability prediction was made possible thanks to Coarse-Grained simulations, enabling a comparison with literature data and proving, once again, how this computational tool can be exploited as a virtual test benching for the screening of new transfectants. In the end, transfection experiments revealed the efficiency of such peptides in gene delivery, especially RALA and HALA2, underlining their outstanding biocompatibility.

Ora più che mai, con l’avvento della pandemia di COVID-19 e lo sviluppo di vaccini basati su vettori non virali, l’attenzione verso il mondo del non-viral gene delivery è aumentata. In questo contesto, i vettori a base peptidica rappresentano un’ alternativa emergente ai vettori virali, per espressione e silenziamento genico, grazie alla loro progettabilità e biocompatibilità. In particolare, questo progetto di tesi si è concentrato sullo studio di quattro sequenze fusogeniche (GALA, KALA, RALA, HALA2), le cui caratteristiche sono state studiate attraverso metodi computazionali e sperimentali. Dal punto di vista computazionale, la struttura secondaria dei peptidi e la loro capacità complessante è stata valutata mediante simulazioni di dinamica molecolare atomistiche, coarse-grained e di metadinamica. Sperimentalmente, i peptidi sono stati sintetizzati e caratterizzati attraverso analisi di Dicroismo Circolare e Spettroscopia in fluorescenza. Inoltre, la capacità complessante in vitro è stata valutata tramite saggio di esclusione SYBR Green I e Dicroismo Circolare. Infine, per esaminare l’espressione genica in cellule HeLa, sono stati eseguiti esperimenti di trasfezione. In termini di caratterizzazione, il confronto tra i risultati ottenuti dalle simulazioni in silico e gli esperimenti in vitro, ha evidenziato l’affidabilità della maggior parte dei metodi computazionali implementati. Il saggio SYBR Green I si è rivelato inadatto per valutare la capacità complessante dei peptidi, ma, attraverso il Dicroismo Circolare, sono state ottenute informazioni qualitative a riguardo. Nonostante ciò, una predizione dell’abilità di complessazione è stata possibile grazie alle simulazioni di dinamica molecolare coarse-grained, che hanno permesso di effettuare un confronto con i dati di letteratura, confermando la validità del metodo computazionale come banco di prova per lo screening di nuovi trasfettanti. Per concludere, gli esperimenti di trasfezione hanno dimostrato l’efficacia di questi peptidi, in particolar modo RALA e HALA2, per il delivery di materiale genetico nelle cellule, evidenziandone l’eccellente biocompatibilità.