Development of a functional 3D bone pain model via microfluidic coaxial bioprinting

Bone pain following pathological or accidental skeletal damages is associated with the mechanical distortion or disruption of nociceptive fibers. The mechanisms underlying human nociceptive activity are not fully understood and the treatment of skeletal-associated pain is yet ineffective. In this thesis work, we aimed to provide the foundations for the development of a three-dimensional (3D) functional model able to effectively simulate mechanisms related to bone pain exploiting microfluidic 3D bioprinting techniques. The development of an interconnected 3D model of the bone-nociceptive interface was explored by fabricating 3D bone and neuro scaffolds. The bone portion was engineered using a novel blend of nanoclay (Laponite, LAP), alginate (ALG) and methylcellulose (MC) polymers (LAP-ALG-MC) able to encapsulate human bone marrow stromal stem cells (HBMSCs). The nociceptive scaffolds were fabricated using an ALG-based blend, modified with RGD moieties and reinforced with Dextran-methacryloyl (DexMA) and Fibronectin (Fib) to facilitate the differentiation and 3D delivery of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)-derived neurons. The possibility of maintaining the two cell types in direct co-culture was investigated with viability assays (Alamar Blue and live/dead) as well as functionality tests (RT-qPCR, histological staining), optimizing the co-culture conditions in order to allow the correct differentiation of HBMSCs and the maintenance of functionality of nociceptors. The engineering and characterization of those specific bioactive materials for bone and neuro scaffold printing, played a crucial role in ensuring the correct development and maturation of the two functional tissues. For this purpose, a free-form bioprinting model is proposed to improve the interconnectivity of HBMSCs and nociceptors. The free-form bioprinting approach harnessed HBMSC-laden ink loaded as supporting bath where hiPSC-derived nociceptors (hiPSCs-NOCs) were printed once encapsulated in the neuro-ink. Altogether, the results acquired in this thesis work will allow the development of a functional bone-neuro interface capable of being employed for in vitro simulations of bone pain providing significant contribution in the development of effective novel drugs against bone pain.

Il dolore osseo a seguito di danni scheletrici patologici o accidentali è associato alla distorsione meccanica o alla rottura delle fibre nocicettive. I meccanismi alla base dell'attività nocicettiva umana non sono completamente compresi e il trattamento del dolore associato allo scheletro è ancora inefficace. In questo lavoro di tesi si è proposto di fornire le basi per lo sviluppo di un modello funzionale tridimensionale (3D) in grado di simulare efficacemente i meccanismi legati al dolore osseo sfruttando tecniche di bioprinting 3D microfluidico. Lo sviluppo di un modello interconnesso dell'interfaccia osso-nocicettiva è stato esplorato realizzando uno scaffold 3D osso e neuro. La porzione osso è stata ingegnerizzata utilizzando una nuova miscela di nanoclay (Laponite, LAP), alginato (ALG) e polimeri di metilcellulosa (MC) (LAP-ALG-MC) in grado di incapsulare le cellule staminali stromali del midollo osseo umano (HBMSC). Lo scaffold nocicettivo è stato fabbricato utilizzando una miscela a base di ALG, modificata con frazioni RGD e rinforzata con destrano-metacrilato (DexMA) e fibronectina (Fib) per facilitare la differenziazione e l’incapsulamento 3D di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). La possibilità di mantenere i due tipi cellulari in co-coltura diretta è stata studiata con saggi di vitalità (Alamar Blue e live/dead) e test di funzionalità (RT-qPCR, colorazione istologica), ottimizzando le condizioni di co-coltura al fine di consentire la corretta differenziazione delle HBMSC e il mantenimento della funzionalità dei nocicettori. L'ingegnerizzazione e la caratterizzazione di quei materiali bioattivi specifici per la stampa di scaffold osso e neuro hanno svolto un ruolo cruciale nell'assicurare il corretto sviluppo e maturazione dei due tessuti funzionali. A questo scopo, viene proposto un modello di bioprinting in forma libera per migliorare l'interconnettività di HBMSC e nocicettori. L'approccio di bioprinting a forma libera ha sfruttato il bioink carico di HBMSC come bagno di supporto in cui sono stati stampati i nocicettori derivati da hiPSC (hiPSCs-NOCs) una volta incapsulati nel neuro-bioink. Complessivamente, i risultati acquisiti in questo lavoro di tesi consentiranno lo sviluppo di un'interfaccia funzionale osso-neuro che può essere impiegata per simulazioni in vitro del dolore osseo fornendo un contributo significativo nello sviluppo di nuovi farmaci efficaci contro il dolore osseo.