Relative biological effectiveness of carbon ions : evaluation of vascular damage using an advanced microfluidic model

Introduction: The World Health Organization (WHO) identified cancer as the second leading cause of death, accounting for approximately 9.6 million deaths in 2018. Radiotherapy is usually present in the treatment protocols of many malignancies: it is a loco-regional, non-invasive, painless therapy capable of provoking the necrosis of cancer cells using ionizing radiation. Radiotherapy is applied in at least 50% of all the cancer patients treated with curative purposes: it constitutes a fundamental component of cancer therapy. Most part of the treatments are delivered using a linear accelerator: a beam of electrons is generated and accelerated through a wave-guide that increases their energy from the keV to the MeV range; these electrons strike a tungsten target and produce γ-rays. However, one of the flaws of this approach consists in the fact that it is almost impossible to shield completely the cells neighbouring the target, because of the high complexity of the tissues, in particular capillaries that are characterized by interconnections and continuity. Furthermore, some types of tumour exhibit radio-resistance to classical radiotherapy. A new approach has been introduced nowadays to overcome these limits: hadron therapy. Unlike classical radiotherapy based on photons or electrons, this kind of treatment involves the use of protons and carbon ions, atomic particles that have the advantage of being heavier and having more energy than photons, this allows them to be more effective and accurate in destroying cancer cells. State of the Art: Hadron therapy shows two main advantages with respect to classical radiotherapy: first, the possibility to treat radio-resistant tumours. Secondly, hadron therapy is characterized by a high precision and the conservation of healthy tissues. With this treatment, the energy release, and therefore the destruction of cells, is extremely selective, meaning that only the target is hit with high intensity, while healthy tissues are saved. Due to a crucial drawback of photons irradiation, the healthy tissue that surrounds the cancer mass is irradiated too, leading to potential damages and toxicity: concerning the microvasculature the most common and frequent collateral effects are damages to the cellular membrane and to the internal structures of the cell, in particular the DNA; these are referred to as Single Strand Break (SSB) and Double Strand Break (DSB). Further lateral effects are represented by sterile inflammation, increase in endothelial permeability, endothelial senescence and even apoptosis of the cells. The microvasculature function is essential in the area of regenerative medicine and tissue engineering. However, generating highly vascularized thick tissues in vitro remains a noteworthy challenge, because functional microvascular networks have to provide adequate nutrient and gas exchange, as well as waste removal. Microfluidic models have contributed significantly to the comprehension of the formation and response of microvascular networks to a plethora of biochemical and mechanical signals; this approach permits spatial control over fluids in micrometric channels, that can be explored to broaden the physiological relevance of 3D culture models. Today, the three most important factors for the involvement of microfluidic techniques in 3D cell culture are: the ability of co-culturing cells in a spatially controlled way, the generation of gradients and the control over them and, finally, the integration of perfusion and flow. Microfluidic technology could greatly improve the research in the field of the vasculature, and angiogenesis in particular, enabling Vasculature-on-Chip creating a controllable environment to replicate the in vivo situation. Based on the fabrication method the different microfluidic approaches can be divided into general categories. The one employed in this thesis is the Vasculogenesis- Based Platform: Vasculature On-Chip is created by triggering the biological activity of the cells into forming new vessels and vasculature, rather than engineering the network using technical approaches. This results in a self-assembling network with less control over the geometrical details but, on the bright side, it offers the possibility to create more complex and, potentially, more biologically relevant structures. Guo et al. proved the feasibility of using a microvasculature-on-a-chip model in radiobiological studies. They investigated several parameters: morphological changes, vessel tight adherens junction breakage (VE-cadherin), cell apoptosis, DNA double-strand break and repair and the levels of pro-inflammatory cytokines (IL-6 and IL-8) in the medium, concluding that the microvasculature formed within the microfluidic vasculogenesis device mimics closely the structure of the microvasculature. Materials and Methods: The PDMS device designed is based on the work of Offeddu et al., although it presents some small modifications. The microfluidic chip is composed by three channels: the one in the center is seeded with cells embedded in a fibrin gel that gave sustainment to the cell self-organization in microvascular network (MVN), the two lateral channels are destined to the culture medium. Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) were cultured together with fibroblasts (FB) to generate the MVN; another important factor is the fibrin gel, obtained with the mixture of fibrinogen and thrombin exploiting the same reaction of the coagulation. The irradiation with photons (classical radiotherapy) was performed at Istituto Nazionale dei Tumori, MI, Italy. The machine involved was a linear accelerator Linac Varian (6 MV) DBX model. Instead, the irradiation with carbon ions - hadron therapy - was performed at CNAO (Centro Nazionale Adroterapia Oncologica), PV, Italy. In this case, the machine used was a Synchrotron. The doses chosen for photons irradiation were: 2 Gy, 5 Gy, 8 Gy, 10 Gy and the control (0 Gy); instead, concerning carbon ions irradiation, it was decided to avoid the 10 Gy dose. Following the irradiation process the devices were fixed at two different time points: 3h and 24h, in order to analyze the short term and long term effects of IR. The results evaluated after IR concentrated on the following aspects: permeability alterations and nuclear damages evaluated analyzing the number and the conformation of Double Strand Breaks within the nucleus, visualized through immunofluorescence and confocal microscopy. Results and Discussion: The first step of the experimental work consisted in the optimization of the microfluidic device: the number of chips per device was triplicated to allow a more efficient acquisition of data and a reduction of the production of devices. At the same time the phantom used for irradiation was adapted so that it could be employed for both photons and ions IR. The same PLA holder was used for both applications, altering the quantity of solid water employed based on its purpose. After the formation of the MVN, a morphological analysis was performed; in particular, some significant parameters were examined: the average vessel length in the microfluidic chips which is aligned with data reported in literature, the average vessel diameter coherent with data reported for the same application. However, this result is still far from the physiological value that is similar to the size of a single red blood cell (6-10 μm). The average vessel tortuosity that is comparable with the one computed in a recent paper by Nicolas and Roux. Permeability [cm/s] measures had a double purpose: in non-irradiated chips, to test if the MVN was permeable and, in irradiated networks, to examine the influence of IR and the changes in time post irradiation. It was found that permeability increases with the dose, this result is consistent with data reported in literature. Moreover, permeability values are in the order of 10-7 -10-8 cm/s as in in-vivo capillaries. Furthermore, time doesn’t seem a decisive factor, although a slight increment of permeability can be seen at 24h post IR with respect to 3h. The results obtained following the detection and count of DSBs using immunofluorescence and confocal microscopy show an increase in the number of double-strand breaks as the dose increases. Through the comparison of the average DSB number, 3h and 24h after the delivery of ionizing radiations, it is evident that the number of DSBs decreases with time due to the action of DNA repairing mechanisms. In particular, following photon irradiation, dose and DNA repairing (DSB reduction) are inversely proportional; however, the reduction of DSB in time following carbon ions’ irradiation is not as linear as with photons. A possible explanation of this complexity can be found in the conformation of DSBs, that differs in relation to the type of IR delivered. This last statement is supported by all the data presenting a broad distribution, meaning that the measures of DSBs’ area are very diverse among themselves. Moreover, it is clear that networks irradiated with carbon ions are characterized by a larger DSB area than photon-irradiated ones, also, they present a larger dispersion: to explore this issue the distribution of the areas’ values was evaluated; it highlighted the presence of broader damages to the DNA: clustered double-strand breaks, multiple DSBs closely spaced together, within 10–20 bp (∼1–2 helical turns of the DNA), that create more complex and more mutagenic and cytotoxic lesions. In order to quantify the number of clustered DSBs a threshold was chosen and set for each dose point based on the distribution of the DSB areas: every γ-H2AX foci larger than this value was classified as a cluster. It was found that the number of clustered DSBs increases with the dose and that a larger percentage of clusters is present in the nuclei irradiated with carbon ions. The DSB analysis made it clear that carbon ions irradiation causes larger and clustered damages to the DNA which are more difficult, if not impossible, to repair than the smaller and single ones procured by photons. Conclusions: This work represents one of the steps towards the optimization and refinement of the protocol to accurately and effectively assess the alterations produced by ionizing radiation on human microvasculature: in particular it constitutes the first stage of the evaluation of the Relative Biological Effectiveness (RBE) of carbon ions concerning the damage to the microvasculature surrounding an irradiated cancer mass. Moreover, this model could be used to further analyze the RBE of carbon ions comparing their effects to those of classical radiotherapy or other treatments.

Introduzione: L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha identificato il cancro come la seconda causa di morte, rappresentando circa 9,6 milioni di morti nel 2018. La radioterapia è solitamente presente nei protocolli di trattamento di molte neoplasie maligne: si tratta di una terapia loco-regionale, non invasiva, indolore in grado di provocare la necrosi delle cellule tumorali attraverso l’uso di radiazioni ionizzanti. La radioterapia viene applicata in almeno il 50% di tutti i malati di cancro trattati con scopi curativi: costituisce una componente fondamentale della terapia oncologica. La maggior parte dei trattamenti viene erogata utilizzando un acceleratore lineare: un fascio di elettroni viene generato e accelerato attraverso una guida d’onda, che aumenta la loro energia dal range keV al range MeV; gli elettroni colpiscono un bersaglio di tungsteno e producono raggi γ. Tuttavia, uno dei difetti di questo approccio è il fatto che è quasi impossibile schermare completamente le cellule vicine al bersaglio a causa dell’elevata complessità dei tessuti, in particolare dei capillari che si caratterizzano per le loro interconnessioni e continuità. Inoltre, alcuni tipi di tumore dimostrano una certa radio-resistenza alla radioterapia classica. Un nuovo approccio è stato introdotto per superare questi limiti: l’adroterapia. A differenza della radioterapia tradizionale basata sui fotoni o elettroni, questo tipo di trattamento prevede l’uso di protoni e ioni carbonio, particelle atomiche che hanno il vantaggio di essere più pesanti e di avere più energia dei fotoni, questo permette loro di essere più efficaci e precise nel distruggere le cellule tumorali. Stato dell’Arte: L’adroterapia presenta due vantaggi principali rispetto alla radioterapia tradizionale: prima fra tutte la possibilità di trattare tumori radioresistenti. Il secondo vantaggio dell’adroterapia è la precisione del trattamento e la conservazione dei tessuti sani. Con questo trattamento il rilascio di energia, quindi la distruzione delle cellule, è estremamente selettivo: solo il target viene colpito ad alta intensità, mentre i tessuti sani vengono preservati. A causa del cruciale limite della terapia fotonica anche il tessuto sano che circonda la massa tumorale viene irraggiato, portando a potenziali danni e tossicità. Per quanto riguarda il microcircolo, gli effetti collaterali più comuni e frequenti sono i danni alla membrana cellulare e alle strutture interne della cellula, in particolare il DNA, chiamati Single Strand Break (SSB) e Double Strand Break (DSB). Ulteriori effetti collaterali sono rappresentati dall’infiammazione sterile, dall’aumento della permeabilità endoteliale, dalla senescenza endoteliale e persino dall’apoptosi delle cellule. La funzione del microcircolo risulta essenziale nell’area della medicina rigenerativa e dell’ingegneria tissutale, tuttavia la generazione in vitro di tessuti spessi, altamente vascolarizzati, rimane una sfida degna di nota, perché reti microvascolari funzionali devono fornire un adeguato scambio di nutrienti e gas e la rimozione dei rifiuti; I modelli microfluidici hanno contribuito in modo significativo alla comprensione della generazione e della risposta delle reti microvascolari ad una pletora di segnali biochimici e meccanici. Gli approcci microfluidici consentono il controllo spaziale sui fluidi in canali micrometrici, che potrebbero essere ulteriormente studiati per ampliare la rilevanza fisiologica dei modelli di coltura 3D. Oggi, i tre fattori più importanti per il coinvolgimento delle tecniche microfluidiche nella coltura cellulare 3D sono: la capacità di co-coltivare le cellule, in modo controllato in termini spaziali, la generazione di gradienti e il controllo su di essi ed infine, l’integrazione di perfusione e flusso. La tecnologia microfluidica potrebbe migliorare notevolmente la ricerca nel campo della vascolarizzazione, e dell’angiogenesi in particolare, grazie ad un Microcircolo-Su-Chip che può creare un ambiente controllabile per replicare la situazione in vivo. Sulla base del metodo di fabbricazione, i diversi approcci microfluidici possono essere suddivisi in categorie. Quello impiegato in questa tesi è una piattaforma basata sulla vasculogenesi: il Microcircolo-Su-Chip non viene creato con metodi tecnici, ma innescando l’attività biologica dei vasi che porta alla formazione di nuovi vasi e vascolarizzazione. Ciò si traduce in una rete autoassemblante, con meno controllo sulle caratteristiche geometriche ma, allo stesso tempo, che offre la possibilità di creare strutture più complesse e, potenzialmente, più rilevanti dal punto di vista biologico. Guo et al. hanno dimostrato la fattibilità dell’utilizzo di un modello di questo tipo in studi radiobiologici. Gli autori hanno studiato diversi parametri: cambiamenti morfologici, rottura delle giunzioni occludenti dei vasi (VE-caderina), apoptosi cellulare, rottura e riparazione della doppia elica del DNA e livelli di citochine pro-infiammatorie (IL-6 e IL-8) nel mezzo, concludendo che la rete microvascolare formatasi all’interno del dispositivo di vasculogenesi microfluidica imita da vicino la struttura del microcircolo in vivo. Materiali e Metodi: Il dispositivo in PDMS progettato si basa sul lavoro di Offeddu et al., con alcune piccole modifiche. Il chip microfluidico è composto da tre canali: quello al centro è seminato con cellule incorporate in un gel di fibrina per dare sostegno all’auto-organizzazione cellulare nella rete microvascolare (MVN), i due canali laterali sono destinati al terreno di coltura. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state coltivate insieme ai fibroblasti (FB) per generare l’MVN; un altro fattore importante è il gel di fibrina, ottenuto tramite la miscela di fibrinogeno e trombina sfruttando la stessa reazione della coagulazione. L’irraggiamento con fotoni (radioterapia classica), è stato eseguito presso l’Istituto Nazionale dei Tumori, MI, Italia. La macchina coinvolta è un acceleratore lineare Linac Varian (6 MV) modello DBX; invece, l’irraggiamento con ioni carbonio - adroterapia - è stato eseguito presso CNAO (Centro Nazionale Adroterapia Oncologica), PV, Italia. In questo caso, la macchina utilizzata è un sincrotrone. Le dosi scelte per l’irraggiamento con fotoni sono: 2 Gy, 5 Gy, 8 Gy, 10 Gy e il controllo (0 Gy). Per quanto riguarda l’irraggiamento con ioni carbonio, si è deciso di evitare la dose di 10 Gy. Seguendo il processo di irraggiamento i dispositivi sono stati fissati a due diversi istanti temporali: 3h e 24h, al fine di analizzare gli effetti a breve e lungo termine delle radiazioni ionizzanti. I risultati valutati dopo IR si sono concentrati sui seguenti aspetti: alterazioni della permeabilità e danni nucleari valutati attraverso la ricerca di Double Strand Breaks all’interno del nucleo, visualizzati attraverso l’immunofluorescenza e l’osservazione al microscopio confocale. Risultati e Discussione: La prima fase del lavoro sperimentale è stata incentrata sull’ottimizzazione del dispositivo microfluidico: il numero di chip per dispositivo è stato triplicato per consentire una più efficiente acquisizione dei dati e una riduzione della produzione di device. Contemporaneamente, il phantom utilizzato per l’irraggiamento è stato adattato in modo da poter essere impiegato sia per l’irraggiamento con fotoni: lo stesso holder in PLA per entrambe le applicazioni, ma una quantità di acqua solida diversa a seconda della funzione ricoperta. Dopo la formazione del network è stata condotta un’analisi morfologica; in particolare alcuni paramentri significativi sono stati calcolati: la lunghezza media dei vasi nei chip microfluidici risulta allineata con i dati riportati in letteratura, il diametro medio dei vasi è coerente con i dati riportati per la stessa applicazione. Tuttavia, questo risultato è ancora lontano dal valore fisiologico, simile alla dimensione di un singolo globulo rosso (6-10 μm). Infine, La tortuosità media dei vasi - 1.99 - è paragonabile a quella calcolata in un recente articolo di Nicolas e Roux. Le misure di permeabilità hanno un duplice scopo: in primo luogo, nei chip non irraggiati, verificare la capacità della rete di essere perfusa e, nelle reti irraggiate, esaminare l’influenza delle radiazioni ionizzanti e le variazioni nel tempo dopo l’irraggiamento. La permeabilità aumenta con la dose, questo risultato è coerente con i dati riportati in letteratura. Inoltre, i valori di permeabilità sono nell’ordine di 10-7 -10-8 cm/s come nei capillari in-vivo. Si deve aggiungere che il tempo non sembra essere un fattore decisivo, anche se un leggero incremento di permeabilità può essere visto a 24h post IR rispetto a 3h. I risultati ottenuti a seguito del rilevamento e del conteggio dei DSB, mediante immunofluorescenza e microscopia confocale, mostrano un aumento del numero di DSB all’aumentare della dose. Attraverso il confronto del numero medio di DSB, 3h e 24h dopo la somministrazione delle radiazioni ionizzanti, è evidente che il numero di DSB diminuisce nel tempo a causa dell’azione dei meccanismi di riparazione del DNA. In particolare, a seguito dell’irraggiamento con fotoni, la dose e la riparazione del DNA (riduzione dei DSB) sono inversamente proporzionali; tuttavia, la riduzione dei DSB nel tempo, dopo l’irraggiamento con ioni carbonio, non è così lineare come nell’irraggiamento con fotoni. Una possibile spiegazione a questa complessità può essere trovata nella conformazione dei DSB, che differisce in relazione al tipo di irraggiamento erogato; infatti, tutti i dati presentano una distribuzione molto elevata, il che significa che le misure dell’area dei DSB sono molto diverse tra loro. Inoltre, è chiaro che le reti irraggiate con ioni carbonio sono caratterizzate da un’area dei DSB più ampia rispetto a quelle irraggiate con fotoni, in più, esse presentano una dispersione significativamente maggiore: per esplorare questo problema è stata valutata la distribuzione dei valori delle aree, che ha evidenziato la presenza di danni più ampi al DNA: cluster di DSB, cioè DSB multipli ravvicinati tra loro, entro 10-20 bp (∼1-2 giri elicoidali del DNA), che creano lesioni più complesse e più mutagene e citotossiche. Per quantificare il numero dei cluster di DSB, è stata scelta e impostata una soglia per ogni punto di dose in base alla distribuzione delle aree dei DSB: ogni γ-H2AX foci più grande di questo valore è stata classificata come cluster. È stato riscontrato che il numero di cluster aumenta con la dose e che una percentuale maggiore di cluster è presente nei nuclei irraggiati con ioni carbonio. L’analisi dei DSB ha portato alla luce che l’irraggiamento con ioni carbonio provoca danni più grandi e raggruppati al DNA più difficili, se non impossibili, da riparare rispetto a quelli più piccoli e singoli procurati dai fotoni. Conclusioni: Questo lavoro rappresenta uno dei passi verso l’ottimizzazione e il raffinamento del protocollo per valutare, in modo accurato ed efficace, le alterazioni prodotte dalle radiazioni ionizzanti sul microcircolo umano: in particolare costituisce la prima fase della valutazione della Relative Biological Effectiveness (RBE) degli ioni carbonio riguardante il danno al microcircolo che circonda una massa tumorale irraggiata. Inoltre, questo modello potrebbe essere utilizzato per analizzare ulteriormente la RBE degli ioni carbonio confrontando i loro effetti con quelli della radioterapia classica e di altri trattamenti.