Progettazione di blend polimerici per la coltura in vitro di pneumociti

The aim of this thesis is the design and preparation of a material suitable for the 3D cultivation of alveolar epithelial cells of the lungs. The final objective is to obtain a polymeric blend that can overcome the limitations of Matrigel, currently considered the gold standard for such cells in a 3D environment. The requirements of this material were ease of production and reproducibility, adherence to certain mechanical specifications and the creation of an environment that would favour cell adhesion and proliferation. The materials chosen for the new blend were gelatin and chitosan, both of which are already used in cell culture. The materials were dissolved in a solution of dH2O in acetic acid and cross-linked by genipin, then frozen and freeze-dried. Different formulations with different genipin concentration and cross-linking time were tested. Then, the swelling % values of the samples in dH2O and the gel fraction were calculated for each of the formulations used. The samples obtained were subjected to compression tests, in order to calculate the average values of elastic modulus, stiffness, residual strain and maximum stress. With the intention of studying the cross-linking mechanism, all the solutions were subjected to a time sweep test using a rheometer. Finally, in vitro biological tests were carried out in order to verify the possible cytotoxicity of the samples obtained, and their cytocompatibility was then investigated on L929 fibroblasts and MLE-15 murine alveolar lung cells. Samples were obtained with a cylindrical shape and blue colour due to the cross-linking process. All blends showed good stability in dH2O up to 60 days. The samples obtained from a solution of Gelatin1%-Chitosan1% and Gelatin 2%-Chitosan 1% showed, the desired elastic modulus. Cytotoxicity tests showed that the genipin remaining in the samples was cytotoxic. Consequently, two separate techniques were developed to remove it from the specimens upstream of the seeding process. Cytocompatibility tests on L929 fibroblasts gave positive results, showing a significant increase in cell viability 7 days after seeding, but no differences between the two methods used. With regard to the culture of MLE-15 cells, both methods showed increasing metabolic activity values over the 7-day test period on the blends tested, but not on the gelatine-only control, to which the cells did not adhere due to inadequate mechanical properties. In conclusion, two of the formulations tested (Gelatin2%-Chitosan1%; Gelatin1%-Chitosan1%) were shown to have promising characteristics for the in vitro culture of alveolar epithelial cells.

L'obiettivo di questo lavoro di tesi è la produzione di un materiale adatto alla semina 3D di cellule epiteliali alveolari polmonari. L'intenzione finale è quello di porre le basi per la produzione di un blend polimerico che permetta di superare i limiti del Matrigel, ad oggi considerato il gold standard per la coltura di tali cellule in ambiente 3D. I requisiti di tale materiale sono la facilità di ottenimento e la riproducibilità, l'aderenza a determinate specifiche meccaniche e la realizzare di un ambiente che favorisca l'adesione e la proliferazione cellulare. I materiali scelti per la produzione di tale blend sono stati gelatina e chitosano, entrambi materiali già utilizzati nelle colture cellulari. I materiali sono stati sciolti in una soluzione di dH2O in acido acetico e reticolate tramite genipina ed infine congelati e liofilizzati. Sono state sperimentate formulazioni differenti con diversi parametri di concentrazione di genipina e tempo di reticolazione. In seguito, sono stati calcolati i valori di swelling % dei campioni in dH2O e la gel fraction per ognuna delle formulazioni utilizzate. In seguito, i provini ottenuti da tali soluzioni sono stati sottoposti a prove meccaniche a compressione. Al fine di studiare il meccanismo di reticolazione, tramite un reometro tutte le soluzioni sono state sottoposte ad un test di time sweep. Sono state infine condotte prove cellulari in vitro al fine di verificare l'eventuale citotossicità dei campioni ottenuti, e ne è stata in seguito verificata la citocompatibilità su fibroblasti L929 e cellule polmonari alveolari murine MLE-15. Sono stati ottenuti campioni dalla forma cilindrica e dal colore blu, dovuto alla presenza di genipina. I blend hanno dimostrato avere buona stabilità in dH2O. I campioni ottenuti da una soluzione di Gelatina1%-Chitosano1% e Gelatina 2%-Chitosano 1% hanno mostrato, a seguito dell'Analisi Dinamico Meccanica, il modulo elastico desiderato. I test di citotossicità hanno evidenziato come la genipina residua risulti citotossica dopo l’incubazione nel mezzo di coltura. Sono, di conseguenza, state sviluppate due tecniche distinte purificare i provini a monte del processo di semina. Le prove di citocompatibilià su fibroblasti L929 hanno mostrato un aumento significativo della vitalità cellulare dopo 7 giorni dalla semina, senza evidenziare tuttavia differenze tra i due metodi utilizzati. Per quanto riguarda invece la coltura di cellule MLE-15, per entrambi i metodi sono stati mostrati valori di attività metabolica crescente sui blend testati, ma non sul controllo di sola gelatina, sulla quale le cellule non hanno aderito a causa delle proprietà meccaniche inadeguate. In conclusione, sono stati selezionati due blend (Gelatina2%-Chitosano1%; Gelatina1%-Chitosano1%) che possiedono caratteristiche promettenti per la coltura in vitro di cellule epiteliali alveolari.