Pre-vascularized spheroids to support the formation of a vascular network in 3D in vitro models

Despite the rapid advancement of 3D in vitro models in replicating the physiology of specific tissues, one of the major limitation in achieving in vivo-like functionality relies on the generation of a fully functional and perfusable capillary network. Here, an innovative approach for the creation of an interconnected in vitro capillary-like network, starting from pre-vascularized spheroids, is presented. To do this, we first developed a high-throughput, easy-to-use, non-adhesive agarose micromold for the production of pre-vascularized 3D spheroids and then, encapsulated these units into fibrin-based hydrogels capable of supporting the interconnection between them. Spheroids, obtained by combining Human Umbilical Vein Endothelial Cells GFP (HUVECs-GFP) and human Bone Marrow-derived Stem Cells (hBMSCs) in 1:1 ratio were characterized for shape and dimension, viability, metabolic activity and expression of some key endothelial markers up to 7 days. A good seeding uniformity was confirmed allowing the formation of a high number of units, which, by day 3, presented both high values of vitality and a capillary-like network. Additionally to assess the adaptability of the micromold, spheroids were also generated by co-culturing Human Dermal Microvascular Endothelial Cells GFP (HDMECs-GFP) and hBMSCs. For the evaluation of the potential and the processability of spheroids to be used as micron-sized pre-vascularized units inside an extracellular matrix, engineered devices of different scales were taken into account. More in detail, millimeter- and micrometer-sized devices were subsequently designed and fabricated to test the angiogenic sprouting activity of the fibrin-embedded spheroids. The extensive in vitro interconnection between sprouts from neighbouring spheroids in both devices, suggested the great potential of these units to support the creation of a microvascular network inside engineered constructs.

Nonostante i modelli 3D in vitro abbiano fatto numerosi progressi nel replicare la fisiologia di specifici tessuti, una delle principali limitazioni nel raggiungimento di una completa funzionalità riguarda la difficoltà di ottenimento di un network capillare completamente funzionale e perfondibile. In questo lavoro di tesi, viene presentato un metodo innovativo per la creazione di una rete capillare in vitro, a partire da sferoidi pre-vascolarizzati. A tal proposito, per prima cosa, abbiamo sviluppato una micromold, non adesiva e semplice da utilizzare per l’elevata produzione di sferoidi 3D pre-vascolarizzati e poi, incapsulato queste unità in idrogeli a base di fibrina in grado di sostenere l’interconnesione tra loro. Sferoidi formati da cellule endoteliali della vena ombelicale umana GFP (HUVECs-GFP) e cellule staminali umane derivate dal midollo osseo (hBMSCs), poste in rapporto 1:1, sono stati caratterizzati fino a 7 giorni di coltura in termini di forma e dimensione, vitalità, attività metabolica ed espressione di alcuni marcatori endoteliali chiave. Una buona uniformità di semina ha permesso la formazione di un buon numero di unità che, al terzo giorno, ha mostrato la presenza di un network capillare ed elevati valori di vitalità. Inoltre, per valutare la versatilità della micromold, gli sferoidi sono stati generati anche ponendo in co-coltura cellule endoteliali dermiche microvascolari umane GFP (HDMECs-GFP) e BMSC. Per la valutazione del potenziale e della processabilità degli sferoidi di essere utilizzati come unità pre-vascolarizzate di dimensioni micrometriche all’interno di una matrice extracellulare, sono stati presi in considerazione dispositivi ingegnerizzati su diversa scala. Più dettagliatamente, sono stati successivamente progettati e fabbricati dispositivi di dimensioni millimetriche e micrometriche, al fine di testare il potenziale angiogenico degli sferoidi, una volta incapsulati in gel di fibrina. In entrambi i dispositivi utilizzati, l’ampia interconnessione tra sferoidi vicini ha evidenziato la possibilità di sostenere la creazione di una rete microvascolare all’interno di costrutti ingegnerizzati, a partire da queste unità pre-vascolarizzate.