Cholangiocarcinoma-on-chip : development and characterization of a liver tumor model in a microfluidic platform

Cholangiocarcinoma (CCA) is a biliary epithelium cancer with high mortality rates and limited therapeutic options. Therefore, a better understanding of CCA pathophysiological mechanisms is essential to develop new effective curative strategies, highlighting the need for a reliable preclinical model. In recent years, Organ-on-Chip (OoC) technology has emerged as a promising tool for cancer research, being potentially able to recapitulate the tumor microenvironment in vitro. The aim of this thesis was to develop an CCA-on-chip model for drug screening, specifically focusing on the study of intrahepatic cholangiocarcinoma (iCCA). Microfluidic devices were designed and fabricated at Politecnico di Milano (MI), whereas biological experiments were carried out at Humanitas Clinical and Research Center (Rozzano, MI). A PDMS three channel chip was conceived to host in the central channel a co-culture of iCCA cells and cancer associated fibroblasts (CAFs), embedded in an optimized collagen/fibrin hydrogel, flanked by an endothelial tubule in one lateral channel. An ad hoc medium composition ensured the retaining of typical cell morphology, proliferation rate and phenotype. Live/Dead assays confirmed high cell viability and confocal microscopy showed the effective 3D rearrangement of cells on chip. Dextran diffusion assays and COMSOL simulations allowed to investigate the diffusion of molecules of interest through the hydrogel matrix and the endothelial barrier. Furthermore, hydrogel mechanical characterizations (i.e., evaluation of hydraulic permeability and Young’s modulus), allowed to verify the stability of bare hydrogel over time and to assess matrix changes due to cell-cell interactions. Quantitative real time (qRT)-PCR proved the increase in the expression of key markers of cells co-cultured in 3D on chip, compared to 2D standard cultures, as well as the time-dependent increase in the gene expression of matrix proteins known to be secreted in vivo, due to the cross-talk between iCCA cells and CAFs. Immunofluorescence and bright field images of the 3D construct corroborated hydrogel stability and matrix protein deposition. Overall, results showed the successful development of a iCCA-on-chip platform, able to recapitulate iCCA microenvironment and biological mechanisms, potentially useful for drug screening applications.

Il colangiocarcinoma (CCA) è un tumore dell'epitelio biliare caratterizzato da alti tassi di mortalità e limitate opzioni terapeutiche. Pertanto, il bisogno di comprendere meglio i meccanismi fisiopatologici del CCA, al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche efficaci, sottolinea la necessità di un modello preclinico affidabile. Negli ultimi anni, gli Organ-on-Chip (OoC) si sono rivelati strumenti promettenti nell’ambito della ricerca sul cancro, essendo potenzialmente in grado di simulare il microambiente tumorale in vitro. Lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare un modello di CCA-on-chip per screening di farmaci, focalizzandosi specialmente sullo studio del colangiocarcinoma intraepatico (iCCA). I dispositivi microfluidici sono stati progettati e fabbricati presso il Politecnico di Milano (MI), mentre gli esperimenti biologici sono stati effettuati presso Humanitas Clinical and Research Center (Rozzano, MI). Un chip in PDMS a tre canali è stato pensato per ospitare nel canale centrale una co-coltura di cellule iCCA e di fibroblasti cancro-associati (CAF), incorporati in un gel ottimizzato di collagene e fibrina, affiancato da un tubulo endoteliale in un canale laterale. Un terreno di coltura ad hoc ha garantito il mantenimento della morfologia cellulare tipica, del tasso di proliferazione e del fenotipo. I saggi Live/Dead hanno confermato l'alta vitalità cellulare e la microscopia confocale ha mostrato l'effettiva riorganizzazione 3D delle cellule nel chip. Le analisi di diffusione del destrano e le simulazioni COMSOL hanno permesso di studiare la diffusione delle molecole di interesse attraverso la matrice del gel e la barriera endoteliale. Inoltre, le caratterizzazioni meccaniche del gel (i.e., valutazione della permeabilità idraulica e del modulo di Young) hanno consentito di verificare la stabilità nel tempo del gel senza cellule e di valutare i cambiamenti della matrice dovuti alle interazioni cellula-cellula. La real time PCR quantitativa (qRT-PCR) ha dimostrato l'aumento nell’espressione dei marcatori chiave delle cellule co-coltivate in 3D sul chip, rispetto alle colture standard 2D, così come l'aumento tempo-dipendente nell'espressione genica di proteine di matrice secrete in vivo, a causa del cross-talk tra cellule iCCA e CAF. Le immagini del costrutto 3D in immunofluorescenza e in campo chiaro hanno confermato la stabilità del gel e la deposizione di proteine di matrice. Nel complesso, i risultati hanno mostrato con successo lo sviluppo di un modello iCCA-on-chip, in grado di replicare il microambiente e i meccanismi biologici dell’iCCA e potenzialmente utile per effettuare test farmacologici.