Engineering the process of Endochondral Ossification to study Ewing Sarcoma

Ewing Sarcoma (EwS) is the second most frequent bone tumor occurring in children, adolescent and young adults, affecting mostly long bones. The treatment of the localized disease has good outcomes (70-80% patient survival), but in advanced metastatic stages current therapies still have limited success ( 30%). Therefore, new therapeutic approaches are needed to improve patient prognosis. Currently, traditional 2D in vitro models are not effectively reproducing the complex bone-tumor microenvironment and all the attempts in creating an engineered mouse that presents the peculiar EwS oncogenic mutation failed, thus limiting the investigation of mechanisms underlying metastasis formation and the discovery of new therapeutic targets. Hence, new in vitro models have to be developed aiming at replicating the bone-tumor microenvironment and suitable for the investigation of tissue-related disease mechanisms. The generation of advanced bone microenvironments for the study of tissue-specific diseases is a challenging process, requiring the balanced interplay between tissue specific cells and external support substrate or matrix. Trying to implement this cross-talk among the involved components, this PhD project first investigated the generation and characterization of a more exploited bone-tumor cross-talk between mature bone and breast cancer metastasis. The obtained results were then taken into account to build an adequate biological model for the establishment of the EwS metastatic niche. The long bones of children and young adults mainly develop through a process called endochondral ossification (ECO), involving different coordinated actions of several cell populations. The deregulation of developmental pathways and microenvironmental factors specifically active during ECO can be involved and even trigger EwS metastasis formation. Two alternative models of ECO were developed. The first model was based on the induction of hypertrophic chondrocyte differentiation in pectin-scaffolds with different cross-linking degree and enriched with hydroxyapatite, to evaluate the effect of the supporting matrix mechanical properties on cell differentiation. The second was based on the co-culture of hypertrophic cartilage micromasses with endothelial cells and bone mesenchymal cells in a 3D printed device. First, the vascularization of the ECO niche was recapitulated in vitro, which is currently obtained after in vivo implantation, secondly, this model was used to investigate possible interactions between the ECO process and EwS progression, studying EwS cell proliferating and migrating pathways.

Il Sarcoma di Ewing (EwS) è il secondo tumore osseo più frequente che colpisce bambini, adolescenti e giovani adulti, agendo principalmente sulle ossa lunghe. Il trattamento del tumore primario ha buoni risultati (70-80% di possibilità di sopravvivenza del paziente), ma in presenza di metastasi avanzate le terapie presenti hanno ancora un successo limitato (~30%). Pertanto, nuovi approcci terapeutici sono necessari per migliorare la prognosi del paziente. I modelli tradizionali in vitro 2D non sono in grado di riprodurre efficacemente il complesso microambiente del tumore osseo. Inoltre, tutti i tentativi di creare un topo ingegnerizzato che presenti la peculiare mutazione oncogenica di questo sarcoma sono falliti. Queste limitazioni riducono le possibilità di analizzare i meccanismi alla base del processo metastatico e la scoperta di nuovi target terapeutici. Quindi devono essere sviluppati nuovi modelli in vitro volti a replicare il microambiente del tumore osseo, e che possano essere usati per studiare i meccanismi coinvolti nello sviluppo di patologie tipiche di questi tessuti. La generazione di questi modelli avanzati di microambiente osseo per lo studio di malattie tessuto-specifiche è un processo impegnativo, che richiede un’equilibrata interazione tra cellule specifiche del tessuto con il substrato o la matrice di supporto esterno. Focalizzandosi sul cross-talk tra le parti coinvolte, questo progetto di dottorato ha prima studiato la generazione e la caratterizzazione di un tumore osseo per lo studio del cross-talk tra osso maturo e metastasi del cancro al seno. I risultati ottenuti sono stati quindi utilizzati come base per sviluppare un modello biologico per la nicchia metastatica di Sarcoma di Ewing. Le ossa lunghe di bambini e giovani adulti si sviluppano principalmente attraverso un processo chiamato ossificazione endocondrale (ECO), il quale coinvolge diversi processi coordinati svolti da numerose popolazioni cellulari. La sregolazione nella crescita e altri fattori microambientali concomitanti all’ECO possono contribuire e persino promuovere la formazioni di metastasi EwS. In questo progetto sono stati sviluppati due diversi modelli di ECO. Il primo è basato sull'induzione alla differenziazione di condrociti ipertrofici coltivati in scaffold di pectina a diverso grado di reticolazione e arricchiti con idrossiapatite, aspetto utile allo studio dell'effetto della matrice di supporto con diverse proprietà meccaniche sul differenziamento cellulare. Il secondo modello è basato sulla co-coltura di micromasse cartilaginee ipertrofiche, cellule endoteliali e cellule mesenchimali ossee in un dispositivo stampato in 3D. In primo luogo, la vascolarizzazione della nicchia ECO, che in precedenti studi è stata ottenuta solo dopo l’impianto in vivo, è stata sviluppata in vitro. In secondo luogo, il modello è stato utilizzato per studiare le possibili interazioni tra il processo di ECO e la progressione di EwS, studiando la proliferazione delle cellule EwS e i pathway che regolano la migrazione cellulare.