Scale-down perfusion bioreactor optimization for the production of therapeutic oligonucleotides

Therapeutics RNA oligonucleotides are assuming increasing interest in the present day pharmaceutical landscape thanks to the possibility of extending the range of druggable targets from conventional proteins to RNAs and to the genome itself. One of the most promising method for the production of these molecules is represented by the in-vivo synthesis, that presents several advantage respect to chemical or in-vitro synthesis. Rhodovulum Sulfidophilum purple marine bacterium proved to be a suitable host for the recombinant production of artificial RNA molecules thanks to the capacity of extracellular nucleic acid secretion and to the absence of observable RNases emissions in the culture environment. In this way, nucleic acids production by means of R. Sulfidophilum fermentation in perfusion bioreactors combines the characteristics of in-vivo synthesis with the advantages related to a continuous productive process. In this work a scale-down optimization approach has been adopted for screening multiple operating conditions. Two micro-scale VCDmax experiments (plus one previously conducted by our research group) have been performed for testing the culture's behavior at various perfusion rates when exposed to different aeration conditions. The reliability of this method was cross-validated by comparing the results of spin-tube experiments with the data collected from benchtop-scale perfusion bioreactor. Further measurements on nucleic acid concentration in the culture environment have been performed to relate the cells productivity with the operating conditions. In future work, further benchtop-scale experiments are required for the assessment of performance parameters for high-densities cultivations and to provide samples for the quantitative and qualitative analyses of oligonucleotides productivity.

Gli oligonucleotidi terapeutici a RNA stanno suscitando un crescente interesse nel panorama farmaceutico odierno, soprattutto grazie alla possibilità di estendere la gamma di bersagli farmacologici dalle proteine convenzionali a specifiche sequenze di RNA e al genoma stesso. Uno dei metodi più promettenti per la produzione di queste molecole è rappresentato dalla sintesi in-vivo, che presenta diversi vantaggi rispetto alla sintesi chimica o in-vitro. Il batterio marino viola Rhodovulum Sulfidophilum si è rivelato essere un ottimo mezzo per la produzione ricombinante di molecole di RNA artificiali grazie alla capacità di secernere gli acidi nucleici prodotti nell'ambiente extracellulare e all'assenza di emissioni rilevabili di RNase nell'ambiente di cultura. In questo modo, la produzione di acidi nucleici per mezzo di fermentazione di R. Sulfidophilum in bioreattori a perfusione combina le caratteristiche positive della sintesi in-vivo con i vantaggi legati a un processo produttivo in continuo. In questo lavoro è stato adottato un approccio di ottimizzazione in scala ridotta (scale-down experiment) per lo screening di differenti condizioni operative. Sono stati eseguiti due esperimenti del tipo VCDmax in microscala (più uno precedentemente condotto dal nostro gruppo di ricerca) con lo scopo di testare il comportamento delle culture sottoposte a diversi tassi di perfusione quando esposte a diverse condizioni di aerazione. L'affidabilità di questo metodo è stata convalidata confrontando i risultati degli esperimenti in spin-tube con i dati raccolti dal bioreattore a perfusione su scala di laboratorio.