Sviluppo di un modello 3D in vitro di retina

Globally about 285 million people are affected by diseases that cause low vision, many of which affect the retina. Among these, the most common are age-related macular degeneration (AMD), glaucoma and diabetic retinopathy. These diseases are associated with multiple changes in retinal structural components and their triggering mechanism are still not well understood; this results in the lack of curative therapeutic treatments. The development of in vitro retinal models to understand the pathogenesis of these diseases is an increasingly pressing need; however, most models in the literature are still oversimplified. In the present thesis work, a 3D in vitro retinal model was created. It includes the layers involved in the development of degenerative diseases such as AMD: Bruch's membrane, RPE (retinal pigment epithelium) and photoreceptor layer. For this purpose, a cell co-culture insert was designed to mount the prosthetic Bruch's membrane. Permeability tests, previous mechanical characterization and culture of ARPE-19 cells allowed the selection of the ideal electrospun Bruch's membrane scaffold, that replicated the function of a semipermeable barrier, the formation of a confluent monolayer and the expression of tight junctions. Finally, a bioink consisting of a blend of sodium alginate and gelatin was developed. Characterization tests revealed that such a bioink has excellent degradability, printability and biocompatibility characteristics and it can be used for 3D bioprinting of the photoreceptor layer on the Bruch's membrane-RPE complex. Further studies are needed to assess the viability of the photoreceptors after printing; however, in this work, the ideal microenvironments were investigated for the development of a multilayer retinal model that is a promising tool for studies on the pathogenesis of retinal degenerative diseases.

Globalmente circa 285 milioni di persone sono affette da patologie che causano ipovisione, molte delle quali colpiscono la retina. Tra queste le più diffuse sono: degenerazione maculare senile (DMS), glaucoma e retinopatia diabetica. Si tratta di patologie associate ad alterazioni di molteplici componenti strutturali della retina e di cui ancora oggi non sono ben noti i meccanismi scatenanti, questo determina la mancanza di trattamenti terapeutici risolutivi. Lo sviluppo di modelli retinici in vitro che permettano di comprendere la patogenesi di queste malattie è un bisogno sempre più impellente; tuttavia, la maggior parte dei modelli presenti in letteratura risultano ancora troppo semplificati. Nel presente lavoro di tesi è stato realizzato un modello retinico 3D in vitro che comprende gli strati coinvolti nello sviluppo di patologie degenerative come DMS: membrana di Bruch, EPR (epitelio pigmentato retinico) e strato dei fotorecettori. A tal proposito, si è progettato un inserto per co-coltura cellulare in cui montare la membrana di Bruch prostetica. Le prove di permeabilità, la precedente caratterizzazione meccanica e la coltura di cellule ARPE-19 hanno permesso di selezionare lo scaffold elettrofilato ideale per membrana di Bruch che replicasse la funzione di barriera semipermeabile e garantisse la formazione di un monostrato confluente e la formazione di giunzioni strette. Infine, si è sviluppato un bioink costituito da un blend di alginato di sodio e gelatina. Le prove di caratterizzazione hanno rivelato che tale bioinchiostro presenta ottime caratteristiche di degradabilità, stampabilità e biocompatibilità e può essere utilizzato per il 3D bioprinting dello strato dei fotorecettori sul complesso membrana di Bruch – EPR. Sono necessari ulteriori studi per valutare la vitalità dei fotorecettori dopo la stampa, tuttavia, in questo lavoro si sono studiati i microambienti ideali per lo sviluppo di un modello retinico multistrato che costituisce uno strumento promettente per studi sulla patogenesi delle malattie degenerative della retina.