Exploitation of biocatalytic methods for the asymmetric synthesis of biologically active chiral molecules (flavours, fragrances and prodrugs)

During my PhD, I focused on the synthesis of flavours, fragrances and APIs, these molecules are known to be strongly influenced by their absolute and/or relative stereochemical configuration. Indeed, in order to elicit an effect, they must interact with proteins, which may be receptors or enzymes. Since proteins represent a chiral environment, they are able to discriminate stereoisomers of the same molecule, which can thus generate very different effects. Therefore, a stereoselective procedure is mandatory for the production of these biologically active molecules. Although my PhD thesis is presented as a collection of papers that can be considered as self-supporting projects, there is always a narrative thread: the stereoselectivity. In this way, it is possible to divide this thesis into two main areas: -One in which the enzymes were used to promote redox reactions (stereoselective reduction of carbonyl group and C=C double bond). -One in which enzymes were used to promote diastereomeric or enantiomeric resolution. In particular, Chapter 1 presents a methodology that combines two enzymatic activities (Ene-reductases and Alcohol dehydrogenases) to produce enantiomerically enriched halohydrins. These molecules are known to be useful synthons in organic synthesis, and this work describes an efficient and selective method that allows the formation of a single stereoisomer by generating three contiguous stereogenic centres in a single step. This methodology has been applied to a large number of substrates (not commercially available). Furthermore, thanks to a collaboration with the University of Groningen, it has been possible to use several Ene-reductases with opposite enantioselectivity to that of the OYEs (Old Yellow Enzymes), thus obtaining more stereoisomers of the same molecules. In Chapter 2, the synthesis of Jessemal® is reported. The latter is a no natural fragrance, and it is commercialized as a mixture of 8 stereoisomers by the company International Flavors&Fragrances inc (IFF). In this work, the stereoselective synthesis of the most pleasant stereoisomer is presented, where biocatalysis is combined with organic synthesis. The key step, which determines the stereochemistry of the final molecule, exploits the same methodology reported in Chapter 1. Also in this case, thanks to the collaboration with the University of Groningen, it was possible to use enzymes with appropriate enantioselectivity to generate the desired stereoisomer. In addition, as conclusion of the work, a study about the regioselectivity of epoxide ring-opening reaction carried out with carbon nucleophiles is presented. In Chapter 3, enzyme activity is used to promote the resolution of the roasted meat flavour which is an important ingredient in the food industry and it is marketed as a mixture of the cis/trans diastereoisomers raceme form. The aim of this work was to separate the two diastereoisomers because they possess different odour characteristics. To do this, a diastereomeric resolution was carried out by combining Lipases and Laccases in an aqueous solvent. Then, analysing the results obtained, it has been noted that the enzymes also showed high enantioselectivity. Therefore, after separating the two diastereoisomers, enantioselective resolution was performed, using Lipases in an organic solvent. Chapter 4 reports the synthesis of two stereoisomers of Aerangis lactone, a natural fragrance found in orchids and now commercialized by Givaudan as a mixture of diastereoisomers. In this work, in addition to biocatalysis, the vicinal effect was used to promote the diastereoselective synthesis of the fragrance. This effect allows to accelerate intramolecular reactions by inserting two substituents along a linear precursor molecule. Moreover, this effect shows a high stereospecificity: depending on the stereochemical relationship of the two substituents (syn or anti) the cyclization reaction will take place more or less quickly. Thus, once the fragrance had been synthesised as a mixture of diastereoisomers, it was possible to convert them into the open form of -hydroxyesters and then, by exploiting the vicinal effect, to separate them. Subsequently, in collaboration with the University of Wroclaw, it was possible to perform an enantioselective lactonization using microorganisms, thus achieving only one enantiomer from each diastereoisomer. The last project, reported in Chapter 5, differs slightly from the others, indeed it is based on the chiral trimethyl lock (TML). The latter is a linear molecule with three methyl substituents, which has been used to design a prodrug of the anticancer Camptothecin. In this work, a chemo-enzymatic synthesis was developed to functionalise the drug, thus obtaining the prodrug as a mixture of four diastereoisomers, which are characterised by a different stereochemical relationship of the TML substituents. Thus, by exploiting the vicinal effect, it was possible to release the drug with four different rates. Initially, a kinetic study was carried out using NMR spectroscopy on the release rate of isopropanol from TML. Then, the latter was coupled to Camptothecin and, drug release tests was triggered both by enzymes (Esterases and Lipases) and by the acidic environment, typical of tumour cells. Finally, thanks to the collaboration with the University of Milano-Bicocca, it was possible to perform in vitro biological essays that showed a time-prolonged release of Camptothecin from the prodrug.

Durante il mio dottorato, mi sono focalizzata sulla sintesi di aromi, fragranze e APIs, molecole note per essere fortemente influenzate dalla loro configurazione assoluta e/o relativa. Quindi, l’applicazione di una procedura stereoselettiva risulta essere necessaria per la loro produzione. Nonostante la mia tesi di dottorato sia presentata come una collezione di articoli che possono essere considerati come dei progetti a sé stanti, c’è sempre un filo conduttore: la stereoselettività. In questo modo è possibile dividere questa tesi in due aree principali: 1. Una in cui gli enzimi sono usati per promuovere reazioni redox (riduzione stereoselettiva di gruppi carbonilici e legami C=C) 2. Una in cui gli enzimi sono utilizzati per promuovere risoluzioni diastereomeriche o enantiomeriche. Entrando più nel dettaglio, nel Capitolo 1 viene presentata una metodologia che combina due attività enzimatiche (Ene-riduttasi e Alcol deidrogenasi) per produrre aloidrine enantiomericamente pure. Queste molecole sono note per essere dei sintomi molto utilizzati nella sintesi organica e, in questo lavoro viene descritto un metodo efficiente e selettivo che consente la formazione di un solo stereoisomero, generando in un singolo passaggio tre centri stereogenici contigui. Questa metodologia è stata applicata a un ampio numero di substrati (non commercialmente disponibili). Inoltre, grazie a una collaborazione con l’università di Groningen, è stato possibile ampliare la pletora di enzimi utilizzati, e applicare questa metodologia usando Ene-riduttasi con enantioselettiva opposta, ottenendo così stereoisomeri della stessa molecola. Nel Capitolo 2 viene riportata la sintesi del Jessemal®. Quest’ultima è una fragranza non naturale e viene commercializzata come miscela degli 8 stereoisomeri dall’azienda InternationaI Flavours&Fragrances inc (IFF). In questo lavoro viene presentata la sintesi stereoselettiva dello stereoisomero più piacevole in cui la biocatalisi viene affiancata alla sintesi organica. Il passaggio chiave, che determina la stereochimica della molecola finale, sfrutta la stessa metodologia riportata nel Capitolo 1. Anche in questo caso, grazie alla collaborazione con l’Università di Groningen, è stato possibile utilizzare enzimi con enantioselettività tale da poter generale lo stereoisomero desiderato. Inoltre, come conclusione del lavoro, viene presentato uno studio sulla regioselettivià delle reazioni di apertura degli epossidi condotta con nucleofili al carbonio. Nell Capitolo 3 l’attività enzimatica viene utilizzata non per ottenere una sintesi selettiva ma per promuovere la risoluzione dell’aroma arrosto, un importante ingrediente nell’industria alimentare commercializzato come miscela dei diastereoisomeri cis/trans ognuno nella sua forma racema. L’ obiettivo di questo lavoro è stato quello di separare i due diastereoisomeri in quanto dimostrano di avere delle caratteristiche odorose differenti. Per fare questo, è stata condotta una risoluzione diastereomerica combinando Lipasi e Laccasi in solvente acquoso. Inseguito, analizzando i risultati ottenuti, si è visto che gli enzimi mostravano anche una marcata enantioselettività. Quindi, dopo aver separato i due diastereoisomeri, è stata ottenuta anche una risoluzione enantioselettiva utilizzando le Lipasi in solvente organico. Il Capitolo 4 riporta la sintesi di due stereoisomeri dell’Aerangis lattone, una fragranza naturale che si trova nelle orchidee ora commercializzato dalla Givaudan come miscela di diastereoisomeri. In questo lavoro, per promuovere la sintesi stereoselettiva della fragranza, è stata sfruttato, oltre alla biocatalisi, l’effetto vicinale. Quest’ultimo permette la velocizzazione delle reazioni intramolecolari grazie all’inserimento di due sostituenti lungo una molecola lineare. Inoltre, questo effetto mostra un’elevata stereospecificità: in base alla relazione stereochimica dei due sostituenti (syn o anti) la reazione di ciclizzazione avverrà più o meno velocemente. Quindi, una volta sintetizzata la fragranza come miscela di diastereoisomeri, è stato possibile convertire questi ultimi nella forma aperta di -idrossiesteri e poi, sfruttando l’effetto vicinale, separarli. In seguito, grazie alla collaborazione con l’università di Wroclaw, è stato possibile eseguire una lattonizzazione enantioselettiva utilizzando microorganismi, ottenendo così solo due enantiomeri della fragranza. L’ultimo progetto, riportato nel Capitolo 5, si discosta leggermente dagli altri, infatti si basa sul trimethyl lock chirale (TML). Quest’ultimo è una molecola lineare con tre sostituenti metilici, la quale è stata utilizzata per la progettazione di un profarmaco dell’anti-tumorale Camptotecina. In questo lavoro, è stata sviluppata una sintesi chemo-enzimatica per funzionalizzare il farmaco e, ottenendo così il profarmaco come miscela di diastereoisomeri, i quali sono caratterizzati da una differente relazione stereochimica dei sostituenti del TML. In questo modo, sfruttando l’effetto vicinale, è stato possibile ottenere quattro diverse velocità di rilascio del farmaco. Inizialmente è stato fatto uno studio cinetico tramite spettroscopia NMR sulle velocità di rilascio dell’isopropanolo da parte del TML, inseguito è stato accoppiato alla Camptotecina. Sono state fatte delle prove sul rilascio del farmaco sia innescate da enzimi (Esterasi e Lipasi) che da ambiente acido, tipico delle cellule tumorali. Infine, grazie alla collaborazione con l’Università degli Studi di Milano-Bicocca è stato possibile eseguire degli studi biologici in vitro in cui viene mostrato un rilascio prolungato della Camptotecina da parte del profarmaco.