Micropatterned coculture platform for maturing hiPSC-derived ventricular cardiomyocytes and optimization of a novel protocol for their cryopreservation

Cardiovascular diseases (CVDs) are one of the leading causes of death in the world. Thus, it is imperative to develop new approaches to disease diagnosis to lower the deadly effects caused by CVDs. The limited accessibility of primary human cardiomyocytes forces researchers to rely on animal models that can’t replicate the human organs due to inter-species differences. As a solution to this problem, human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have shown great potential in disease modeling, tissue engineering, and drug and toxicity screening. Nevertheless, these cells require a maturation induction in order to display an adult-like phenotype and to represent a reliable in vitro model. Finally, cryopreservation techniques are necessary to enable long-term storage. Through this process, cells will be immediately available for multiple experiments saving time and money. Therefore, this thesis aims to (i) successfully induce hiPSC-derived ventricular cardiomyocytes’ (hiPSC-vCMs) maturity to create a reliable drug screening platform, and (ii) optimize a new cryopreservation protocol for hiPSC-CMs that provides a viability and yield over 80%. Towards the first aim, we induced hiPSC-vCMs’ maturation utilizing two stimuli: coculture with cardiac fibroblasts and surface modification. According to the coculture method, our results suggest a deep connection between the cardiac fibroblast subtype and hiPSC-vCMs’ maturation: ventricular fibroblasts (vCFs) induce further maturation of hiPSC-vCMs as compared to atrial fibroblasts (aCFs). In addition to these results, we demonstrated that coculturing hiPSC-vCMs with vCFs on a micropatterned substrate further enhances their maturation. Towards the second aim, we optimized parameters to cryopreserve hiPSC-CMs with the goal of maintaining high viability and functions. Questions about the optimal cryopreserving medium and the optimal freezing methods were answered. Our results showed that STEMdiff ability to preserve hiPSC-vCMs properties overcomes CryoStor, based on the evidence of today. Moreover, a controlled-rate freezing method looks more reliable than uncontrolled and conventional freezing techniques. In conclusion, this thesis provides an understanding of hiPSC-vCMs with respect to protocol differentiation and maturity induction, as well as their cryopreservation. This work aspires to be a starting point in the development of advanced models that could combine more physiological stimuli in order to better mimic the heart tissue physiology.

Le malattie cardiovascolari sono una delle principali cause di morte al mondo. Pertanto, è fondamentale sviluppare nuovi approcci di diagnosi per ridurre gli effetti mortali delle malattie cardiovascolari. L’accessibilità limitata dei cardiomiociti umani primari costringe i ricercatori a fare affidamento su modelli animali che non sono in grado di replicare gli organi umani a causa delle differenze tra le specie. Come soluzione a questo problema, i cardiomiociti derivati da cellule umane staminali pluripotenti indotte (hiPSC-CM) hanno mostrato un grande potenziale nella replica in vitro di malattie, nell’ingegneria dei tessuti e nello screening farmacologico. Tuttavia, queste cellule richiedono un’induzione della maturazione per mostrare un fenotipo simile ai cardiomiociti adulti e rappresentare un modello in vitro affidabile. Infine, le tecniche di crioconservazione sono necessarie per consentire la conservazione a lungo termine, risparmiando tempo e denaro per futuri esperimenti. Questa tesi mira a (i) indurre con successo la maturità dei cardiomiociti ventricolari derivati da hiPSCs (hiPSC-vCMs) per creare una piattaforma affidabile per lo screening farmacologico e (ii) ottimizzare un nuovo protocollo di crioconservazione per i hiPSC-CMs che fornisce una sopravvivenza e una resa superiore all’80%. Per il primo obiettivo, la maturazione di hiPSC-vCMs è stata indotta utilizzando due stimoli: la co-coltura con fibroblasti cardiaci e la modifica della superficie. I risultati ottenuti suggeriscono una profonda connessione tra il sottotipo di fibroblasto e il livello di maturazione dei hiPSC-vCMs: i fibroblasti ventricolari (vCFs) sono più efficaci rispetto ai fibroblasti atriali (aCFs). Inoltre, la co-coltura dei hiPSC-vCMs con vCFs su un substrato micromodellato migliora ulteriormente il livello di maturazione. Riguardo al secondo obiettivo, si è investigato il mezzo di crioconservazione ottimale e i metodi di congelamento migliori per i hiPSC-CMs. I risultati hanno dimostrato che la capacità di STEMdiff di preservare le proprietà di hiPSC-vCMs supera quella di CryoStor. Inoltre un metodo di congelamento a velocità controllata sembra più affidabile rispetto alle tecniche di congelamento non controllate e convenzionali. In conclusione, questa tesi vuole approfondire il processo delle tecniche di induzione della maturità dei hiPSC-vCMs, nonché le tecniche per crioconservare queste cellule. Questo lavoro vuole essere un punto di partenza per lo sviluppo di modelli avanzati al fine di imitare in vitro la fisiologia del cuore.