Development of crosslinked hyaluronic acid gels for regenerative medicine

The fundamental concept in regenerative medicine is to combine a three-dimensional (3-D) scaffold, with living cells, and/or biologically active molecules forming a tissue engineering construct able to promote the repair and/or regeneration of tissues and organs, although also cell-free scaffolds have shown clinical success, for bone, cartilage and skin tissue repair. Scaffolds are particularly important since their interactions with the cells play a crucial role in the regeneration process. In details, the porous structure of scaffolds provides physical support for cell adhesion, growth and proliferation leading to tissue formation with good spatial and temporal control. Scaffolds can be composed of ceramic, polymeric or composite materials. Among the polymeric materials, hydrogels are the most promising ones due to their high-water content, the physical, chemical, and mechanical properties that can be tuned to mimic natural tissues and their excellent biocompatibility and biodegradability. Hydrogels are three-dimensional networks of hydrophilic polymers held together by covalent, ionic or hydrogen bonds and, in the presence of solvents, they can swell maintaining their original shape forming elastic gels. A recent trend has been to use injectable hydrogels for regenerative medicine, as the injectability provides a minimally invasive and less traumatic alternative to conventional solid scaffolds. The aim of this thesis, therefore, is the production of a biocompatible and cohesive hydrogel requiring low force for injection. Considering its numerous clinical applications, the easy and controllable large-scale production and the anti-inflammatory and immunosuppressive properties, hyaluronic acid (HA) was chosen for the purpose. Due to its short longevity in human body, crosslinking of hyaluronic acid is necessary and for this reason two crosslinking agents were used: butanediol diglycidyl ether (BDDE) and poly(ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDE. A production process was developed keeping industrial scale up in mind optimizing the duration of the crosslinking reaction, the crosslinking agent concentration, the dialysis and granulation steps. For this scope, liquid 1H-NMR and rheological measurements were used. At the end of the process, the elasticity and injectability of HA-BDDE and HA-PEGDE hydrogels were optimal for in situ regenerative medicine applications and any trace of the cytotoxic unreacted crosslinkers has been removed with an efficient dialysis. Finally, a characterization in terms of hyaluronic acid functionalization and morphology and polymeric network structure of the final products using a pharmaceutical grade hyaluronic acid was carried out.

Il concetto fondamentale in medicina rigenerativa è la combinazione di scaffold tridimensionali (3D) con cellule viventi e/o molecole biologicamente attive per formare un complesso di ingegneria tissutale in grado di promuove il riparo e/o la rigenerazione di tessuti e organi; tuttavia, anche scaffold acellulari hanno mostrato successo clinico per la riparazione del tessuto osseo, cartilagineo e cutaneo. Gli scaffold sono particolarmente importanti perché le loro interazioni con le cellule giocano un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione. Nel dettaglio, la struttura porosa degli scaffold offre supporto fisico per l’adesione, la crescita e la proliferazione delle cellule portando alla formazione di un tessuto con ottimo controllo spaziale e temporale. Gli scaffold possono essere composti da materiali ceramici, polimerici o compositi. Tra i materiali polimerici, gli idrogel sono i più promettenti per via del loro elevato contenuto d’acqua, le proprietà fisiche, chimiche e meccaniche che possono essere modificate per mimare i tessuti naturali e l’eccellente biocompatibilità e biodegradabilità. Gli idrogel sono network tridimensionali di polimeri idrofili legati da legami covalenti, ionici o a idrogeno e, in presenza di solventi, sono in grado di rigonfiarsi mantenendo la loro forma originale formando gel elastici. Tendenza recente è di utilizzare idrogel iniettabili per la medicina rigenerativa, poiché l’iniettabilità offre un’alternativa agli scaffold solidi convenzionali minimamente invasiva e meno traumatica. L’obiettivo di questa tesi, quindi, è la produzione di un idrogel biocompatibile e coesivo che richieda una forza limitata per l’iniezione. Considerando le sue numerose applicazioni cliniche, la produzione a larga scala facile e controllabile e le proprietà anti-infiammatore e immunosoppressive, l’acido ialuronico è stato scelto per questo scopo. A causa della lunghezza di vita limitata all’interno del corpo umano, una reticolazione dell’acido ialuronico è necessaria e, per questa ragione, due agenti di reticolazione sono stati utilizzati: butanediol diglycidyl ether (BDDE) e poly(ethylene glycol) diglycidyl ether (PEGDE). Un processo produttivo è stato sviluppato considerando uno scale-up industriale ottimizzando la durata della reazione di reticolazione, la concentrazione dell’agente di reticolazione, gli step di dialisi e granulazione. Per questo scopo, analisi NMR liquido ai protoni e reologiche sono state utilizzate. Alla fine del processo, l’elasticità e l’iniettabilità degli idrogel HA-BDDE e HA-PEGDE erano ottime per applicazioni in situ di medicina rigenerativa e ogni traccia dei citotossici agenti di reticolazione non reagiti era stata rimossa con una dialisi efficace. Infine, una caratterizzazione in termini di funzionalizzazione dell’acido ialuronico e morfologia e struttura del network polimerico del prodotto finito usando un acido ialuronico di grado farmaceutico è stata implementata.