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POLITesi - Archivio digitale delle tesi di laurea e di dottorato

Proteins have a long history as therapeutics, and their use is becoming more widespread in modern medicine. While the number of protein-based drugs is increasing every year, there are still substantial issues with their application. Among these issues, rapid degradation and excretion from patients require frequent administration, which increases both, the possibilities of an immune response and the cost of therapy. To alleviate these challenges, conjugation of polyethylene glycol (PEG) group, or PEGylation, to the protein of interest is a prominent way and has gained popularity in recent years. Despite the favorable characteristics offered by the PEGylation reaction, it is not universally employed as it may result in the generation of a heterogeneous mixture of species that requires additional purification steps. This mixture can compose of mono-PEGylated, di-PEGylated, native protein, unreacted PEG molecules and/or positional isomers. As the heterogenous PEGylated species exhibit different physiochemical properties, adequate separation strategies exploiting the differences of the physiochemical properties, such as charge and weight, are employed to purify the protein of interest. In this study, mono-PEGylated proteins are identified as the product (P) of interest, while other species are identified as impurities. The impurities are classified into two main categories: weak impurities (W) and strong impurities (S), which are identified as the di-PEGylated and un-PEGylated proteins, respectively. To separate the product from the impurities, a batch chromatographic method with a single linear gradient elution is employed. The weak impurities are first to elute, followed by the product and finally the strong impurities. Although the three species have different elution times, due to their structural similarity, they sometimes partially co-elute at the same time resulting in a product/impurity overlap. Strict regulatory requirements in terms of purity and clinical safety need to be met for the product to reach the market. For mixtures containing a large number of product-related impurities, satisfying a high purity specification (Pspec) often results in low product yield. Therefore, due to high purity specifications, the batch purification is often limited in terms of yield-purity trade-off. Using Multicolumn Counter-current Solvent Gradient Purification (MCSGP), a form of continuous chromatography, this purity-yield trade-off has proven to be alleviated. By internally recycling the overlapping region between product and impurity in MCSGP, the loss of product yield can be minimized while maintaining Pspec. As these side fractions are eluted in high conductivity relative to the loading condition, proper inline dilution (ILD) through an equilibration buffer is necessary to lower the conductivity. Moreover, to introduce flexibility in the design process of MCSGP operations, various multi-gradient elution modes were investigated with the goal of achieving a better separation between P and S. A second gradient elution of varying ionic strength can aid in recovering the lost product by enlarging the recycling interval where the overlapping product and impurity are recycled in a continuous MCSGP process, therefore combining multi-gradient elution principles in MCSGP. In this work, starting from a PEG-lysozyme case, process parameters including load amount, elution times and optimal collection interval for optimal yield and productivity were identified using single elution batch chromatography. The process parameters obtained from a single linear gradient elution batch experiment were then used as reference to introduce dual and isocratic multi-gradient elution modes. The process parameters that changed in transitioning from single to multi-gradient elution where the product/strong impurity (P/S) recycling times and second elution gradient concentration. Following the optimization of batch purification in single and multi-gradient elution modes, the process parameters from each mode were used to transition to MCSGP for the PEG-lysozyme case. At a Pspec of 80%, the resulting yield recovery from single, dual and isocratic modes increased by ~10%. Moreover, the MCSGP operations of the single and dual elution modes displayed higher productivity by 4.2% and 2.9%, respectively, while that of the isocratic elution decreased in productivity by 3.1%. After achieving successful results for the PEG-lysozyme case, the study was continued for an industrially relevant therapeutic PEG-protein. For the purification of the PEG-protein, a Pspec of 98% was set. The process with the PEG-protein was initiated using the same method by optimizing the single elution batch chromatography through identifying the elution time, the optimal collection interval window, the salt concentration of the elution buffer. Using a linear gradient, both yield and productivity improved in MCSGP by 5% and 0.2 g/L/hr, respectively. Following the linear gradient batch experiments, dual slope batch experiments were conducted for the PEG-protein case. It was hypothesized that by employing dual gradient elution modes, yield recovery in MCSGP could be enhanced, due to the possibility of recycling larger volumes of P/S by extending the time interval for the overlapping side fraction. Before transitioning to experimental MCSGP for the dual slope case, in order to economize the experimental process in terms of times and materials, optimal MCSGP dual slope yield and productivity results were predicted hypothetically. The hypothetical yield and productivity results were obtained through the ILD factors provided by the MCSGP ChromIQ software and the corresponding dual slope batch experiments. This facilitated in selecting the optimal batch experiments to be conducted in MCSGP. At the Pspec of 98%, the hypothetical predications were validated. Employing a dual gradient in MCSGP, with productivity decreasing to 0.48 g/L/hr, yield increased by 23% (from 73% to 96%) in comparison to the optimal single elution batch experiment, and 17% (from 79% to 96%) in comparison to the single elution MCSGP operation.

Le proteine hanno una lunga storia come terapeutiche e il loro uso sta diventando sempre più diffuso nella medicina moderna. Da una parte il numero di farmaci a base di proteine aumenta ogni anno, dall’altra ci sono ancora problemi sostanziali con la loro applicazione. Tra questi problemi vi sono il rapido degrado e l'escrezione da parte dei pazienti. Pertanto, ciò richiede una somministrazione frequente, che aumenta sia le possibilità di una risposta immunitaria che il costo della terapia. Coniugare un gruppo di polietilenglicole (PEG) con la proteina di interesse è un modo prominente per alleviare queste sfide. Questo metodo, noto come PEGilazione, ha guadagnato popolarità negli ultimi anni. La reazione della PEGilazione può comportare la generazione di una miscela eterogenea di specie, caratterizzata da un diverso numero e posizione di gruppi PEG attaccati. Questa miscela può comporre proteine mono-PEGilate, di-PEGilate, proteine native, molecole PEG non reagite e/o isomeri posizionali. Poiché le specie eterogenee PEGilate mostrano proprietà fisico-chimiche diverse, per purificare la proteina di interesse vengono impiegate strategie di separazione adeguate che sfruttano le differenze delle proprietà fisico-chimiche, come carica e peso. In questo studio, le proteine mono-PEGilate sono identificate come il prodotto (P) di interesse, mentre altre specie sono identificate come impurità. Le impurità sono classificate in due categorie principali: impurità deboli (W) e impurità forti (S). Per separare il prodotto dalle impurità, viene impiegato un metodo cromatografico di tipo batch con un'unica eluizione a gradiente lineare. Le impurità deboli vengono prima eluite, seguite dal prodotto e infine dalle impurità forti. Sebbene tutte e tre le specie abbiano tempi di eluizione diversi, a causa della loro somiglianza strutturale, a volte coeluiscono parzialmente allo stesso tempo determinando una sovrapposizione prodotto/impurità. Affinché il prodotto possa raggiungere il mercato, devono essere soddisfatti severi requisiti normativi in termini di purezza e sicurezza clinica. Per le miscele contenenti un gran numero di impurità relative al prodotto, soddisfare una specifica di elevata purezza (Pspec) spesso si traduce in una bassa resa del prodotto. Pertanto, a causa delle specifiche di elevata purezza, la purificazione batch è spesso limitata in termini di compromesso resa-purezza. Utilizzando la purificazione del gradiente di solvente in controcorrente multicolonna (MCSGP), una forma di cromatografia continua, questo compromesso tra purezza e resa ha dimostrato di essere alleviato. Riciclando internamente la regione di sovrapposizione tra prodotto e impurità in MCSGP, la perdita di resa del prodotto può essere ridotta al minimo mantenendo la Pspec. Di conseguenza, è necessaria un'adeguata diluizione in linea (ILD) tramite tampone di equilibratura prima di riciclare internamente le frazioni laterali del prodotto/impurità. Tuttavia, per soddisfare le specifiche di elevata purezza, l'utilizzo di una sola eluizione a gradiente lineare nei casi con ampia sovrapposizione tra prodotto e forte impurità può comunque comportare lo scarto di una buona quantità di prodotto insieme all'impurità, compromettendo così la resa complessiva del prodotto. I sistemi di eluizione multigradiente consentono una migliore separazione tra le specie. Una seconda eluizione a gradiente di forza ionica variabile può aiutare a recuperare il prodotto perso allargando l'intervallo di riciclaggio in cui il prodotto sovrapposto e l'impurità vengono riciclati in un processo MCSGP continuo, combinando quindi i principi di eluizione multi-gradiente in MCSGP. In questo lavoro, partendo da un caso di lisozima PEG, i parametri di processo, inclusi i tempi di eluizione caratteristici, l'intervallo di raccolta ottimale e il gradiente di eluizione per una resa e una produttività ottimali, sono stati identificati utilizzando la cromatografia in batch standard a eluizione singola. I parametri di processo ottenuti da un singolo esperimento batch di eluizione a gradiente lineare sono stati quindi utilizzati come riferimento per introdurre modalità di eluizione multigradiente doppia e isocratica in batch. I parametri di processo che sono cambiati nella transizione dall'eluizione a gradiente singolo a quella multigradiente, dove i tempi di riciclaggio del prodotto/impurità forte (P/S) e la concentrazione del secondo gradiente di eluizione. Dopo l'ottimizzazione della purificazione batch nell'eluizione a gradiente singolo e multiplo, i parametri di processo di ciascuna modalità sono stati utilizzati per passare a MCSGP per il caso del lisozima PEG. Con una Pspec dell'80%, il recupero della resa risultante dalle modalità singola, doppia e isocratica è aumentato di circa il 10%, nel passaggio dalla cromatografia batch a quella continua. Fatta eccezione per la modalità di eluizione isocratica, le modalità di eluizione singola e doppia hanno mostrato una produttività maggiore rispettivamente del 4,2% e del 2,9%. Dopo aver ottenuto risultati positivi per il caso PEG-lisozima, lo studio è stato proseguito per una proteina PEG terapeutica rilevante a livello industriale. Per la purificazione della proteina PEG è stata impostata una Pspec del 98%. Il processo con la proteina PEG è stato avviato utilizzando lo stesso metodo, ottimizzando gli esperimenti in batch di eluizione singola identificando i tempi di eluizione caratteristici con la finestra dell'intervallo di raccolta ottimale e il gradiente di eluizione. Utilizzando un gradiente lineare, sia la resa che la produttività sono migliorate in MCSGP rispettivamente del 5% e 0,2 g/L/ora. Dopo gli esperimenti batch a gradiente lineare, sono stati condotti esperimenti batch a doppia pendenza per il caso della proteina PEG. Prima di passare all'MCSGP sperimentale per il caso della doppia pendenza, al fine di economizzare il processo sperimentale in termini di tempo e materiale, sono stati previsti ipoteticamente risultati ottimali di resa e produttività della doppia pendenza MCSGP. I risultati ipotetici di resa e produttività sono stati ottenuti attraverso i fattori di diluizione in linea (ILD) forniti dal software MCSGP ChromIQ e dai corrispondenti esperimenti batch a doppia pendenza. Ciò ha aiutato a selezionare gli esperimenti batch ottimali da condurre in MCSGP. Alla Pspec del 98%, le ipotetiche predicazioni sono state convalidate. Impiegando un doppio gradiente in MCSGP, con una produttività che diminuisce a 0,48 g/L/ora, la resa è aumentata del 23% (dal 73% al 96%) rispetto all'esperimento ottimale in batch di eluizione singola e del 18% ( dal 78% al 96%) rispetto all'operazione MCSGP a singola eluizione.

Purification of PEGylated proteins for industrial applications : a transition from linear gradient to multi-gradient elution in batch and MCSGP chromatography to alleviate the purity-yield tradeoff.

Bham, Abdallah Ayub
2021/2022

Abstract

Proteins have a long history as therapeutics, and their use is becoming more widespread in modern medicine. While the number of protein-based drugs is increasing every year, there are still substantial issues with their application. Among these issues, rapid degradation and excretion from patients require frequent administration, which increases both, the possibilities of an immune response and the cost of therapy. To alleviate these challenges, conjugation of polyethylene glycol (PEG) group, or PEGylation, to the protein of interest is a prominent way and has gained popularity in recent years. Despite the favorable characteristics offered by the PEGylation reaction, it is not universally employed as it may result in the generation of a heterogeneous mixture of species that requires additional purification steps. This mixture can compose of mono-PEGylated, di-PEGylated, native protein, unreacted PEG molecules and/or positional isomers. As the heterogenous PEGylated species exhibit different physiochemical properties, adequate separation strategies exploiting the differences of the physiochemical properties, such as charge and weight, are employed to purify the protein of interest. In this study, mono-PEGylated proteins are identified as the product (P) of interest, while other species are identified as impurities. The impurities are classified into two main categories: weak impurities (W) and strong impurities (S), which are identified as the di-PEGylated and un-PEGylated proteins, respectively. To separate the product from the impurities, a batch chromatographic method with a single linear gradient elution is employed. The weak impurities are first to elute, followed by the product and finally the strong impurities. Although the three species have different elution times, due to their structural similarity, they sometimes partially co-elute at the same time resulting in a product/impurity overlap. Strict regulatory requirements in terms of purity and clinical safety need to be met for the product to reach the market. For mixtures containing a large number of product-related impurities, satisfying a high purity specification (Pspec) often results in low product yield. Therefore, due to high purity specifications, the batch purification is often limited in terms of yield-purity trade-off. Using Multicolumn Counter-current Solvent Gradient Purification (MCSGP), a form of continuous chromatography, this purity-yield trade-off has proven to be alleviated. By internally recycling the overlapping region between product and impurity in MCSGP, the loss of product yield can be minimized while maintaining Pspec. As these side fractions are eluted in high conductivity relative to the loading condition, proper inline dilution (ILD) through an equilibration buffer is necessary to lower the conductivity. Moreover, to introduce flexibility in the design process of MCSGP operations, various multi-gradient elution modes were investigated with the goal of achieving a better separation between P and S. A second gradient elution of varying ionic strength can aid in recovering the lost product by enlarging the recycling interval where the overlapping product and impurity are recycled in a continuous MCSGP process, therefore combining multi-gradient elution principles in MCSGP. In this work, starting from a PEG-lysozyme case, process parameters including load amount, elution times and optimal collection interval for optimal yield and productivity were identified using single elution batch chromatography. The process parameters obtained from a single linear gradient elution batch experiment were then used as reference to introduce dual and isocratic multi-gradient elution modes. The process parameters that changed in transitioning from single to multi-gradient elution where the product/strong impurity (P/S) recycling times and second elution gradient concentration. Following the optimization of batch purification in single and multi-gradient elution modes, the process parameters from each mode were used to transition to MCSGP for the PEG-lysozyme case. At a Pspec of 80%, the resulting yield recovery from single, dual and isocratic modes increased by ~10%. Moreover, the MCSGP operations of the single and dual elution modes displayed higher productivity by 4.2% and 2.9%, respectively, while that of the isocratic elution decreased in productivity by 3.1%. After achieving successful results for the PEG-lysozyme case, the study was continued for an industrially relevant therapeutic PEG-protein. For the purification of the PEG-protein, a Pspec of 98% was set. The process with the PEG-protein was initiated using the same method by optimizing the single elution batch chromatography through identifying the elution time, the optimal collection interval window, the salt concentration of the elution buffer. Using a linear gradient, both yield and productivity improved in MCSGP by 5% and 0.2 g/L/hr, respectively. Following the linear gradient batch experiments, dual slope batch experiments were conducted for the PEG-protein case. It was hypothesized that by employing dual gradient elution modes, yield recovery in MCSGP could be enhanced, due to the possibility of recycling larger volumes of P/S by extending the time interval for the overlapping side fraction. Before transitioning to experimental MCSGP for the dual slope case, in order to economize the experimental process in terms of times and materials, optimal MCSGP dual slope yield and productivity results were predicted hypothetically. The hypothetical yield and productivity results were obtained through the ILD factors provided by the MCSGP ChromIQ software and the corresponding dual slope batch experiments. This facilitated in selecting the optimal batch experiments to be conducted in MCSGP. At the Pspec of 98%, the hypothetical predications were validated. Employing a dual gradient in MCSGP, with productivity decreasing to 0.48 g/L/hr, yield increased by 23% (from 73% to 96%) in comparison to the optimal single elution batch experiment, and 17% (from 79% to 96%) in comparison to the single elution MCSGP operation.
KIM, TAE KEUN
ING - Scuola di Ingegneria Industriale e dell'Informazione
22-lug-2022
2021/2022
Le proteine hanno una lunga storia come terapeutiche e il loro uso sta diventando sempre più diffuso nella medicina moderna. Da una parte il numero di farmaci a base di proteine aumenta ogni anno, dall’altra ci sono ancora problemi sostanziali con la loro applicazione. Tra questi problemi vi sono il rapido degrado e l'escrezione da parte dei pazienti. Pertanto, ciò richiede una somministrazione frequente, che aumenta sia le possibilità di una risposta immunitaria che il costo della terapia. Coniugare un gruppo di polietilenglicole (PEG) con la proteina di interesse è un modo prominente per alleviare queste sfide. Questo metodo, noto come PEGilazione, ha guadagnato popolarità negli ultimi anni. La reazione della PEGilazione può comportare la generazione di una miscela eterogenea di specie, caratterizzata da un diverso numero e posizione di gruppi PEG attaccati. Questa miscela può comporre proteine mono-PEGilate, di-PEGilate, proteine native, molecole PEG non reagite e/o isomeri posizionali. Poiché le specie eterogenee PEGilate mostrano proprietà fisico-chimiche diverse, per purificare la proteina di interesse vengono impiegate strategie di separazione adeguate che sfruttano le differenze delle proprietà fisico-chimiche, come carica e peso. In questo studio, le proteine mono-PEGilate sono identificate come il prodotto (P) di interesse, mentre altre specie sono identificate come impurità. Le impurità sono classificate in due categorie principali: impurità deboli (W) e impurità forti (S). Per separare il prodotto dalle impurità, viene impiegato un metodo cromatografico di tipo batch con un'unica eluizione a gradiente lineare. Le impurità deboli vengono prima eluite, seguite dal prodotto e infine dalle impurità forti. Sebbene tutte e tre le specie abbiano tempi di eluizione diversi, a causa della loro somiglianza strutturale, a volte coeluiscono parzialmente allo stesso tempo determinando una sovrapposizione prodotto/impurità. Affinché il prodotto possa raggiungere il mercato, devono essere soddisfatti severi requisiti normativi in termini di purezza e sicurezza clinica. Per le miscele contenenti un gran numero di impurità relative al prodotto, soddisfare una specifica di elevata purezza (Pspec) spesso si traduce in una bassa resa del prodotto. Pertanto, a causa delle specifiche di elevata purezza, la purificazione batch è spesso limitata in termini di compromesso resa-purezza. Utilizzando la purificazione del gradiente di solvente in controcorrente multicolonna (MCSGP), una forma di cromatografia continua, questo compromesso tra purezza e resa ha dimostrato di essere alleviato. Riciclando internamente la regione di sovrapposizione tra prodotto e impurità in MCSGP, la perdita di resa del prodotto può essere ridotta al minimo mantenendo la Pspec. Di conseguenza, è necessaria un'adeguata diluizione in linea (ILD) tramite tampone di equilibratura prima di riciclare internamente le frazioni laterali del prodotto/impurità. Tuttavia, per soddisfare le specifiche di elevata purezza, l'utilizzo di una sola eluizione a gradiente lineare nei casi con ampia sovrapposizione tra prodotto e forte impurità può comunque comportare lo scarto di una buona quantità di prodotto insieme all'impurità, compromettendo così la resa complessiva del prodotto. I sistemi di eluizione multigradiente consentono una migliore separazione tra le specie. Una seconda eluizione a gradiente di forza ionica variabile può aiutare a recuperare il prodotto perso allargando l'intervallo di riciclaggio in cui il prodotto sovrapposto e l'impurità vengono riciclati in un processo MCSGP continuo, combinando quindi i principi di eluizione multi-gradiente in MCSGP. In questo lavoro, partendo da un caso di lisozima PEG, i parametri di processo, inclusi i tempi di eluizione caratteristici, l'intervallo di raccolta ottimale e il gradiente di eluizione per una resa e una produttività ottimali, sono stati identificati utilizzando la cromatografia in batch standard a eluizione singola. I parametri di processo ottenuti da un singolo esperimento batch di eluizione a gradiente lineare sono stati quindi utilizzati come riferimento per introdurre modalità di eluizione multigradiente doppia e isocratica in batch. I parametri di processo che sono cambiati nella transizione dall'eluizione a gradiente singolo a quella multigradiente, dove i tempi di riciclaggio del prodotto/impurità forte (P/S) e la concentrazione del secondo gradiente di eluizione. Dopo l'ottimizzazione della purificazione batch nell'eluizione a gradiente singolo e multiplo, i parametri di processo di ciascuna modalità sono stati utilizzati per passare a MCSGP per il caso del lisozima PEG. Con una Pspec dell'80%, il recupero della resa risultante dalle modalità singola, doppia e isocratica è aumentato di circa il 10%, nel passaggio dalla cromatografia batch a quella continua. Fatta eccezione per la modalità di eluizione isocratica, le modalità di eluizione singola e doppia hanno mostrato una produttività maggiore rispettivamente del 4,2% e del 2,9%. Dopo aver ottenuto risultati positivi per il caso PEG-lisozima, lo studio è stato proseguito per una proteina PEG terapeutica rilevante a livello industriale. Per la purificazione della proteina PEG è stata impostata una Pspec del 98%. Il processo con la proteina PEG è stato avviato utilizzando lo stesso metodo, ottimizzando gli esperimenti in batch di eluizione singola identificando i tempi di eluizione caratteristici con la finestra dell'intervallo di raccolta ottimale e il gradiente di eluizione. Utilizzando un gradiente lineare, sia la resa che la produttività sono migliorate in MCSGP rispettivamente del 5% e 0,2 g/L/ora. Dopo gli esperimenti batch a gradiente lineare, sono stati condotti esperimenti batch a doppia pendenza per il caso della proteina PEG. Prima di passare all'MCSGP sperimentale per il caso della doppia pendenza, al fine di economizzare il processo sperimentale in termini di tempo e materiale, sono stati previsti ipoteticamente risultati ottimali di resa e produttività della doppia pendenza MCSGP. I risultati ipotetici di resa e produttività sono stati ottenuti attraverso i fattori di diluizione in linea (ILD) forniti dal software MCSGP ChromIQ e dai corrispondenti esperimenti batch a doppia pendenza. Ciò ha aiutato a selezionare gli esperimenti batch ottimali da condurre in MCSGP. Alla Pspec del 98%, le ipotetiche predicazioni sono state convalidate. Impiegando un doppio gradiente in MCSGP, con una produttività che diminuisce a 0,48 g/L/ora, la resa è aumentata del 23% (dal 73% al 96%) rispetto all'esperimento ottimale in batch di eluizione singola e del 18% ( dal 78% al 96%) rispetto all'operazione MCSGP a singola eluizione.
Tesi di laurea Magistrale
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