Engineering biomimetic elastomers

Resilin is a natural elastomeric protein found in the exoskeleton of insects. This protein has interesting properties like high resilience and noteworthy energy storage. Indeed, it is commonly studied for potential use in tissue engineering and other fields, e.g., drug delivery. Resilin derivatives such as Resilin-Like Polypeptides (RLPs), are also used for similar purposes. We focused on the study of a short characteristic conserved sequence of Resilin (7 amino acids, SDSYGAP), aiming to express the elastomeric properties of an entire complex protein with a small oligopeptide. The necessity to use this reductionist approach is that the macromolecule is particularly complex and difficult to produce on a large scale, with inevitable negative feedback from the economic and applicability point of view. Among the possible peptide chemical mutations, the halogenation is a possibility, and it is known to enhance the intermolecular interactions, promoting self-assembly of peptide systems. In fact, halogenation is a minimal structural modification that introduces a great diversity in the supramolecular behavior of the peptide sequence. Herein, we demonstrate that the introduction of halogen atoms, bromine, on the tyrosine residue of the peptide (SDSY(3,5-Br)GAP) promotes the formation of resilient fibril-like aggregates, which are not formed in the non-modified sequence. The study shows that the new material has an elastic behavior thanks to the engineering of the material with halogen atoms. Furthermore, we were able to identify a certain self-healing behavior of the brominated material. In parallel, molecular dynamics (MD) simulations of clusters of non-modified vs halogenated peptides were conducted to verify the stability and molecular behavior of peptides aggregates. The MD simulations confirm that the presence of halogen bonds, promoted by the bromine atoms, confers greater structuration to the peptide favoring fibrillar aggregation and higher stability to the peptide aggregates. In this thesis I report how it is possible, through modifications such as halogenation, to introduce unique properties into a material. Specifically, in a considerably small brominated peptide, SDSY(3,5-Br)GAP, it was possible to reproduce the elastic property of the full length protein (Resilin) possesses more than 600 amino acids). On the other hand, confirming the effect of the modification, the natural/wild-type peptide counterpart, SDSYGAP, does not show elasticity. In parallel, we investigated the possible biomedical application of this small elastomeric peptide. In the recent years, the development of new biomaterials with possible applications in tissue regeneration paved a fertile ground for the creation of new techniques and strategies capable of exploring the potential characteristics of new materials. In this field, the electrospinning has become a particularly widespread and effective technique for obtaining scaffolds of polymeric fibers. In this thesis I report the electrospinning of this very small, brominated peptide SDSY(3,5-Br)GAP. The results obtained by electrospinning of peptides as a single component and peptides in combination with other compounds (e.g., gelatin) are reported. In principle, the synergy between the two compounds should results into the emergence of new properties of the scaffold. One of the project objectives is to obtain polymeric fibers having better performances than those offered by the full-length Resilin protein. First electrospinning attempts of the single brominated peptide were carried out: the results obtained are promising as it is not usual to obtain fibers through electrospinning from low molecular weight peptides. Indeed, proteins that are commonly electrospun have weights of hundreds kDa. Then, different solvents were tested, but the resulting scaffold was inappropriate for a potential use in biomedical or tissue engineering applications. Furthermore, different peptide/gelatin mixtures have been prepared by testing the widest range of possibilities. In all the conditions analyzed, mixing the peptide with gelatin in different ratios results in well-defined morphology (filaments). Subsequently, the matrices were cross-linked to make them suitable for applications in the biological field, because, without the crosslinking process, the matrices are completely soluble in an aqueous environment. The mechanical properties of these Resilin/gelatin mix scaffolds were also evaluated with good results. Given the high interest of the scientific community for sequences prone to aggregation (for example our brominated peptide), we have introduced and developed a computational approach with the intention of predicting the state of aggregation of some selected sequences for further application. In this context, Coarse Grain Molecular Dynamics models (CG-MD) were exploited to predict the behavior of the peptide in solution. However, to reduce computational costs we have firstly refine the in-silico model of a shorter model pentapeptide sequence (based on DFNKF sequence). Here, we show the computational tools used to probe the aggregation propensity (AP) of a library of wild type (WT) peptides of the xFxxF sequence (being “x” any of the 20 amino acids). We generated all the possible peptide combinations (8,000) and using CG-MD simulations we estimated the AP, in order to choose the sequences for experimental studies aimed to evaluate their self-assembly behavior. Finally, in the last part of this thesis, the same computational model used for the pentapeptide will be exploited on the sequence of 7 amino acids of Resilin (SDSYGAP) and on two other highly repeated sequences within the full-length Resilin protein (SSSYGAP and SDTYGAP). These tests of molecular dynamics have been performed with interesting results however they are preliminary and require further studies.

La Resilina è una proteina elastomerica naturale che si trova nell'esoscheletro degli insetti. Questa proteina ha proprietà interessanti come un'elevata resilienza e un notevole accumulo di energia. In effetti, è comunemente studiata per l’utilizzo nell'ingegneria dei tessuti e in altri campi, ad esempio nel drug delivey. Anche i derivati della Resilina come i polipeptidi simili alla resilina (RLP) sono utilizzati per scopi simili. Ci siamo concentrati sullo studio di una breve sequenza caratteristica conservata di Resilina (7 aminoacidi, SDSYGAP), con l'obiettivo di esprimere le proprietà elastomeriche di un'intera proteina utilizzando solamente un piccolo oligopeptide. La necessità di utilizzare questo approccio riduzionista nasce dal fatto che la macromolecola è particolarmente complessa e difficile da produrre su larga scala, con inevitabili ripercussioni dal punto di vista economico e di applicabilità. Tra le differenti mutazioni chimiche del peptide, l'alogenazione è una possibilità, ed è nota per accrescere le interazioni intermolecolari, favorendo l'autoassemblaggio. Infatti, l'alogenazione è una minima modifica strutturale che introduce una grande diversità nel comportamento supramolecolare. Qui, dimostriamo che l'introduzione di atomi di alogeno, bromo, sul residuo di tirosina del peptide (SDSY(3,5-Br)GAP) promuove la formazione di aggregati resilienti fibril-like, che non si formano nella sequenza non modificata. Lo studio mostra che il nuovo materiale ha un comportamento elastico grazie all'ingegnerizzazione del materiale con atomi di alogeno. Inoltre, siamo stati in grado di identificare un comportamento di autoguarigione del nuovo materiale bromurato. Parallelamente, sono state condotte simulazioni di dinamica molecolare (MD) di cluster di peptidi non modificati rispetto a quelli alogenati per verificare la stabilità e il comportamento molecolare degli aggregati. Le simulazioni MD confermano che la presenza di legami alogeno, promossi dagli atomi di bromo, conferisce maggiore strutturazione al peptide favorendo l'aggregazione fibrillare conferendo maggiore stabilità agli aggregati. In questa tesi riporto come sia possibile, attraverso modifiche come l'alogenazione, introdurre proprietà esclusive in un materiale. Nello specifico, in un peptide bromurato considerevolmente piccolo, SDSY(3,5-Br)GAP, è stato possibile riprodurre la proprietà elastica della proteina a lunghezza intera (Resilina, che possiede più di 600 aminoacidi). D'altra parte, a confermare l'effetto della modifica, la controparte peptidica naturale, SDSYGAP, non mostra alcuna elasticità. Parallelamente, abbiamo studiato una possibile applicazione biomedica di questo piccolo peptide elastomerico. Negli ultimi anni, lo sviluppo di nuovi biomateriali utilizzabili nella rigenerazione dei tessuti ha aperto un terreno fertile per la creazione di nuove tecniche e strategie in grado di esplorare le potenzialità di nuovi materiali. In questo campo l'elettrofilatura è diventata una tecnica particolarmente diffusa ed efficace per l'ottenimento di scaffold di fibre polimeriche. In questa tesi riporto l'elettrofilatura di questo piccolissimo peptide bromurato SDSY(3,5-Br)GAP. Vengono mostrati i risultati ottenuti mediante elettrofilatura di peptidi come componente singolo e peptidi in combinazione con altri composti (ad esempio gelatina). In linea di principio, la sinergia tra i due composti dovrebbe favorire la comparsa di nuove proprietà dello scaffold. Uno degli obiettivi del progetto è ottenere fibre polimeriche con prestazioni migliori rispetto a quelle offerte dalla proteina Resilina a lunghezza intera. Sono stati effettuati i primi tentativi di elettrofilatura del singolo peptide bromurato: i risultati ottenuti sono promettenti in quanto non è consueto ottenere fibre per elettrofilatura da peptidi a basso peso molecolare. Infatti, le proteine comunemente elettrofilate hanno pesi di centinaia di kDa. Quindi, sono stati testati diversi solventi, ma gli scaffold prodotti risultano inadatti per un utilizzo in applicazioni biomediche. Inoltre, sono state preparate diverse miscele di peptidi/gelatina testando la più ampia gamma di possibilità. In tutte le condizioni analizzate, la miscelazione del peptide con la gelatina in rapporti diversi determina una morfologia (filamenti) ben definita. Successivamente le matrici sono state reticolate per renderle idonee ad applicazioni in campo biologico, poiché, senza il processo di reticolazione, le matrici sono completamente solubili in ambiente acquoso. Sono state valutate con buoni risultati anche le proprietà meccaniche di questi scaffold di miscela di resina/gelatina. Dato l'elevato interesse della comunità scientifica per le sequenze soggette ad aggregazione (ad esempio il nostro peptide bromurato), abbiamo introdotto e sviluppato un approccio computazionale con l'intento di prevedere lo stato di aggregazione di alcune sequenze selezionate per ulteriori applicazioni. In questo contesto, sono stati utilizzati modelli di Coarse Grain Molecular Dynamics (CG-MD) per prevedere il comportamento del peptide in soluzione. Tuttavia, per ridurre i costi computazionali, abbiamo in primo luogo perfezionato il modello in-silico di una sequenza modello pentapeptidica (basata sulla sequenza DFNKF). Qui, mostriamo gli strumenti computazionali utilizzati per sondare la propensione all'aggregazione (AP) di una libreria di peptidi wild type (WT) della sequenza xFxxF (essendo "x" uno qualsiasi dei 20 amminoacidi). Abbiamo generato tutte le possibili combinazioni peptidiche (8.000) e utilizzando simulazioni CG-MD abbiamo stimato l'AP, al fine di scegliere le sequenze per studi sperimentali valutando il comportamento di autoassemblaggio. Infine, nell'ultima parte di questa tesi, lo stesso modello computazionale utilizzato per il pentapeptide sarà sfruttato sulla sequenza di 7 aminoacidi della Resilina (SDSYGAP) e su altre due sequenze altamente ripetute all'interno della proteina Resilina intera (SSSYGAP e SDTYGAP). Questi test di dinamica molecolare sono stati eseguiti con risultati interessanti, tuttavia sono preliminari e richiedono ulteriori studi.