Design and development of a fluorescence detection system for molecular biology POC devices

In recent years, the demand for medical diagnosis has influenced the development of Point of Care (POC) devices, which aim to bring the equivalent of laboratory analysis to the patient's site. Following this trend, advances in technology, microfluidics, and molecular biology have led to the miniaturization of such diagnostic devices using the Lab-on-Chip (LoC) approach. Nucleic acid detection is widely studied and employed in different biomolecular applications, including the detection of infectious diseases. The SARS-CoV-2 virus has furtherly increased the need for diagnostic testing tools that can rapidly and sensitively detect the virus to control infectious transmission. A promising new nucleic acid detection technique, CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-CRISPR-Associated), has been seen as a revolutionary technique for POC diagnostic testing. The discovery of the protein Cas13a's collateral RNA-cleavage activity was crucial in the development of CRISPR-based sensing. To satisfy POC market demand, STMicroelectronics is developing a novel CRISPR-based device to investigate SARS-CoV-2 infections. An embedded read-out system able to detect fluorescence signals allows the new portable diagnostic tool to deliver quick results outside of the typical laboratory environment. The purpose of this thesis was to design and develop a new fluorescence detection system based on an advanced and miniaturized CMOS image sensor. The work has focused on designing specific hardware with dedicated firmware to handle sensor functionalities. The system can acquire fluorescence images during CRISPR-Cas analyses by tuning different optical parameters. In addition to the previous system, the new one implements an LED synchronization strictly related to the sensor exposure time, thus reducing the source of variability introduced by the excitation light. The new sensor was characterized and integrated into the CRISPR-Cas instrument to perform molecular biology tests for SARS-CoV-2 detection. Its outcomes were evaluated concerning the Rotor-Gene Q gold standard and the previous detection system. The experiments have shown comparable results to a molecular biology instrument analysis gold standard and high resolution detecting low-intensity signals. Thanks to its features it ensures faster diagnostic response in CRISPR-Cas analysis detecting positive outcomes around 5 minutes after the reaction began. This made the new sensor as the perfect candidate to replace the old one.

Negli ultimi anni, la domanda di diagnosi medica ha influenzato lo sviluppo di dispositivi Point of Care (POC), che mirano a portare l'equivalente delle analisi di laboratorio sul posto del paziente. Seguendo questa tendenza, i progressi nella tecnologia, nella microfluidica e nella biologia molecolare hanno portato alla miniaturizzazione di tali dispositivi diagnostici utilizzando l'approccio Lab-on-Chip (LoC). Il rilevamento degli acidi nucleici è ampiamente studiato e impiegato in diverse applicazioni biomolecolari, tra cui il rilevamento di malattie infettive. Il virus SARS-CoV-2 ha ulteriormente aumentato la necessità di strumenti diagnostici in grado di rilevare rapidamente e in modo sensibile il virus per controllare la trasmissione infettiva. Una nuova promettente tecnica di rilevamento degli acidi nucleici, la CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-CRISPR-Associated), è stata considerata una tecnica rivoluzionaria per i test diagnostici POC. La scoperta dell'attività collaterale di clivaggio dell'RNA da parte della proteina Cas13a è stata fondamentale per lo sviluppo del rilevamento basato su CRISPR. Per soddisfare la domanda del mercato POC, STMicroelectronics sta sviluppando un nuovo dispositivo basato su CRISPR per rilevare infezioni da SARS-CoV-2. Un sistema di read-out incorporato, in grado di rilevare i segnali di fluorescenza, consente al nuovo strumento diagnostico portatile di fornire risultati rapidi al di fuori del tipico ambiente di laboratorio. Lo scopo di questa tesi è stato quello di progettare e sviluppare un nuovo sistema di rilevazione della fluorescenza basato su un sensore di immagine CMOS avanzato e miniaturizzato. Il lavoro si è concentrato sulla progettazione di un hardware specifico con un firmware dedicato per gestire le funzionalità del sensore. Il sistema può acquisire immagini di fluorescenza durante le analisi CRISPR-Cas regolando diversi parametri ottici. In aggiunta al sistema precedente, il nuovo sistema implementa una sincronizzazione del LED strettamente correlata al tempo di esposizione del sensore, riducendo così la fonte di variabilità introdotta dalla luce di eccitazione. Il nuovo sensore è stato caratterizzato e integrato nello strumento CRISPR-Cas per l'esecuzione di test di biologia molecolare per il rilevamento della SARS-CoV-2. I suoi risultati sono stati valutati rispetto al gold standard Rotor-Gene Q e al precedente sistema di rilevazione. Gli esperimenti hanno mostrato risultati paragonabili a quelli di uno strumento gold standard di biologia molecolare e un'alta risoluzione nel rilevare segnali di bassa intensità. Grazie alle sue caratteristiche, garantisce una risposta diagnostica più rapida nell'analisi CRISPR-Cas, rilevando risultati positivi circa 5 minuti dopo l'inizio della reazione. Questo ha reso il nuovo sensore il candidato perfetto per sostituire quello precedente.