3D PDMS micropatterned substrates to observe cellular response to substrate stiffness

In the last decades engineered substrates with different stiffnesses have been developed to understand the cellular mechanobiology and to mimic the cellular microenvironment both in physiological and pathological conditions. The used of 3D micropatterned substrates, characterized by different structural stiffness is an approach allowing the modeling and the observation of cellular response facing different conditions. Polydimethylsiloxane (PDMS) is a gold standard in microfabrication for biological application, due to high resolution patterning and the biocompatibility to cell culture microenvironments. In this project, the microfabrication process of PDMS substrates has been developed and optimized to obtain micropillar substrates with a controlled size and distribution: PDMS micropillar substrates act as flexible active structures, whose stiffness can be modulated by shape of the pillar and by the mechanical properties of the material itself. Starting from a reference work, a molding on SU-8 photoresist has been developed to enable alternative and versatile fabrication of substrates on multilayer structures through photolithography. The selected photoresist is SU-8 2005, which has been patterned to obtain high quality molds for PDMS soft-lithography. The process optimization has been reached by following a standard protocol, combining and testing different power settings of the photolithography exposure. The measurements of resulting SU-8 structures, with interferometric profilometer (Profilm3D) and SEM microscopy, have been performed and combined to characterize each substrate. The measurements, crucial for the fine-tuning the process, had to be indirectly executed on the replica of PDMS structures, due to the impossibility of SEM and Profilm3D to evaluate the characterization of high aspect ratio micro-cavities molds. The optimization of the parameters process allows to fabricate molds, which, consequently, characterized by 3.3 µm section diameter, aspect ratio (height/width) higher than 1 with spatial density ranging from 4 µm up to 5.5 µm. The same protocol has been adopted to manufacture oval micropillars, having 3.5 µm and 7 µm as minor and major axis with 8 µm as interspacing, to introduce substrates characterized by anisotropic stiffness. PDMS micropillar stiffness can be modulated by five main factors: the aspect ratio (height/width) and the cross-section of the pillar (circular, oval), the Young modulus of the material, which in turns depends on the PDMS concentration ratio (9:1, 10:1), the curing temperature (70°C, 80°C) and the curing time (15h). Eleven conditions have been selected to represent the widest values of PDMS micropillar substrates in this fabrication to undergo to a preliminary biological validation. Each sample (11 conditions x 3 replicates) have been arranged in a 96 multi-well plate, coated with fibronectin (FN), which promotes cell attachment, and, subsequently, seeded H5V endothelial murine cells. After an incubation of 24h, phase-contrast and fluorescence images (Fitch filter) have been captured to examine the cellular morphology in terms of mean cell area [µm2] and circularity ratio [-]. Cells survived and spread on the substrates in 24h, showing differences depending on their different shape and stiffness properties. Fluorescence imaging allows the estimation of spreading by the measurements of shape parameters. The protocol reveals to be successful despite the insufficient number of data which did not establish any statistically significant observations.

Negli ultimi decenni sono stati sviluppati substrati ingegnerizzati con diverse rigidità per comprendere la meccanobiologia cellulare e imitare il microambiente cellulare sia in condizioni fisiologiche che patologiche. L'uso di substrati 3D micropatternati, caratterizzati da una diversa rigidità strutturale, è un approccio che consente di modellare e osservare la risposta cellulare in diverse condizioni. Il polidimetilsilossano (PDMS) è un gold standard nella micro-fabbricazione per applicazioni biologiche, grazie alla modellazione ad alta risoluzione e alla biocompatibilità con i microambienti delle colture cellulari. In questo progetto, il processo di micro-fabbricazione di substrati in PDMS è stato sviluppato e ottimizzato per ottenere substrati di micropilastri con dimensioni e distribuzione controllate: I substrati di micropilastri in PDMS agiscono come strutture attive flessibili, la cui rigidità può essere modulata dalla forma del pilastro e dalle proprietà meccaniche del materiale stesso. Partendo da un lavoro di riferimento, è stato sviluppato uno stampaggio su fotoresist SU-8 per consentire la fabbricazione alternativa e versatile di substrati su strutture multistrato attraverso la fotolitografia. Il fotoresist selezionato è il SU-8 2005, che è stato modellato per ottenere stampi di alta qualità per la litografia del PDMS. L'ottimizzazione del processo è stata raggiunta seguendo un protocollo standard, combinando e testando diverse impostazioni di potenza dell'esposizione fotolitografica. Le misure delle strutture SU-8 risultanti, con profilometro interferometrico (Profilm3D) e microscopia SEM, sono state eseguite e combinate per caratterizzare ciascun substrato. Le misure, cruciali per la messa a punto del processo, sono state eseguite indirettamente sulla replica di strutture in PDMS, a causa dell'impossibilità di SEM e Profilm3D di valutare la caratterizzazione di stampi con micro-cavità ad alto rapporto d'aspetto. L'ottimizzazione dei parametri di processo ha permesso di fabbricare stampi che, di conseguenza, sono caratterizzati da un diametro di sezione di 3,3 µm, un rapporto d'aspetto (altezza/larghezza) superiore a 1 e una densità spaziale che va da 4 µm a 5,5 µm. Lo stesso protocollo è stato adottato per produrre micropilastri ovali, aventi 3,5 µm e 7 µm come asse minore e maggiore con 8 µm come interspazio, per introdurre substrati caratterizzati da rigidità anisotropa. La rigidità dei micropilastri in PDMS può essere modulata da cinque fattori principali: il rapporto d'aspetto (altezza/larghezza) e la sezione trasversale del pilastro (circolare, ovale), il modulo di Young del materiale, che a sua volta dipende dal rapporto di concentrazione del PDMS (9:1, 10:1), la temperatura (70°C, 80°C) e il tempo di polimerizzazione (15h). Sono state selezionate undici condizioni per rappresentare i valori più ampi di substrati di micropilastri in PDMS in questa fabbricazione, da sottoporre a una validazione biologica preliminare. Ogni campione (11 condizioni x 3 repliche) è stato disposto in una piastra a 96 pozzetti multipli, rivestito con fibronectina (FN), che favorisce l'adesione delle cellule, e, successivamente, seminato con cellule endoteliali murine H5V. Dopo un'incubazione di 24 ore, sono state acquisite immagini a contrasto di fase e a fluorescenza (filtro Fitch) per esaminare la morfologia cellulare in termini di area cellulare media [µm2] e rapporto di circolarità [-]. Le cellule sono sopravvissute e si sono distribuite sui substrati in 24 ore, mostrando differenze in base alle loro diverse proprietà di forma e rigidità. L'imaging in fluorescenza consente di stimare la diffusione attraverso la misurazione dei parametri di forma. Il protocollo si è rivelato efficace ma il numero insufficiente di dati che non ha permesso di stabilire osservazioni statisticamente significative.