Development of liver-based multiorgan-on-chip platforms as advanced in vitro tools to predict drug metabolism effects

Pre-clinical models used to evaluate drug efficacy and safety during the drug development process (DDP) mainly rely on traditional two-dimensional (2D) cell cultures, considered too simplistic and often ineffective, or animal experimentations, which are costly, time-consuming, and not truly representative of human responses. Clinical translation of current pre-clinical models thus remains limited, eventually causing attrition and leading to high rates of failure during clinical trials. The principal attrition factor is undetected toxicity, with hepatic and cardiac toxicities playing a critical role and being the main responsible of safety-related drug withdrawals from the market. These drawbacks might be overcome by the recently developed Organs-on-Chip (OoC) technology. OoC are sophisticated in vitro systems capable of recapitulating pivotal architecture and functionalities of human organs. OoC are receiving increasing attention from the stakeholders of the DDP, particularly concerning drug efficacy and safety applications. When a drug is administered in the human body, it is metabolized by the liver and the resulting compound may cause unpredicted toxicity on off-target organs such as the heart. In this sense, several liver and heart models have been adopted to assess the toxicity of new or recalled drugs. Recent advances in OoC technology are making available platforms encompassing multiple organs fluidically connected to efficiently assess and predict the systemic effects of compounds. Such Multi-Organs-on-Chip (MOoC) platforms represent a disruptive solution to study drug-related effects on multiple organs simultaneously, which results particularly useful to predict liver metabolism on target and off-target tissues to ultimately improve drug efficacy and safety testing in the pre-clinical phases of the DDP. The present PhD thesis aimed at developing novel technological solutions to design advanced cell culture platforms encompassing liver metabolism for drug efficacy and safety applications. By tailoring native hepatic- and cardiac- specific cues, the ultimate goal was the generation and testing of physiologically relevant and functional 2D and three-dimensional (3D) in vitro MOoC platforms. A microfluidic technique will be first presented for micropatterning protein domains and cell cultures within permanently bonded OoC devices. This method is based on the use of polydimethylsiloxane (PDMS) layers coupled with the plasma ablation technique for selective protein removal. We will show how this technique can be employed to miniaturize a liver in vitro model based on micropatterned co-cultures directly within a dual-compartment MOoC platform suitable for pharmacokinetic-based drug screening applications. The effects of Tegafur, a non-toxic compound liver-metabolized into the cytotoxic 5-Fluorouracil, on colon cancer cell line was assessed using two microfluidic devices where microgrooves and valves systems are used to model drug diffusion between culture compartments. Upon confirmation of the technical feasibility of the method and the ability of the liver model to metabolize drugs, such technique was then adopted to develop a dual-compartment MOoC platform encompassing a 2D liver and a 3D heart model specifically designed for drug safety applications. The administration of the drug Terfenadine, a cardiotoxic compound liver-metabolized into the non-cardiotoxic Fexofenadine, proved that liver metabolism and a fine control over drug diffusion are fundamental to elicit a physio-pathological cardiac response. Additionally, in such MOoC platform, cardiac cells can be mechanically trained to achieve a beating microtissue, whose electrophysiology can be directly recorded in vitro. However, such liver model is a 2D model based on hepatic cell lines and while being able to efficiently metabolize compounds and amenable for preliminary drug efficacy and safety testing, cannot thoroughly mimic the native hepatic microenvironment. In fact, the liver has a very defined architecture where parenchymal (i.e., hepatocytes) and non-parenchymal (e.g., endothelial cells) cells are separated by a thin extracellular matrix (ECM) layer and continuously influence each other by paracrine interactions and contact signaling. For this reason, we further developed a technique to generate in vitro functional vascularized 3D liver microtissues encompassing primary cells (e.g., hepatocytes and endothelial cells), where the integration of a perfusable cylindrical channel can be eventually exploited to better study systemic toxicity of liver-metabolized drugs on target and off-target organs within a next generation MOoC platform. In the present PhD thesis both technical and biological novelties were achieved. Advancements comprised: i) the development of a microfluidic protein patterning technique to generate a metabolically competent liver model within MOoC platforms, ii) the adoption of such technique to functionally evaluate efficacy and safety of drugs on target (i.e., tumor) and off-target (i.e., heart) microtissues, and iii) the development of a platform enabling for the efficient generation of perfusable vascularized microtissues, better mimicking the architecture of native organs. These platforms were pivotal in the establishment of functional liver, tumor, and cardiac constructs, and may be eventually exploited to get new biological insights related to cellular responses when subjected to liver-metabolized drugs and/or combinations of physiologically relevant stimuli within a unique device.

I modelli preclinici utilizzati per valutare l'efficacia e la sicurezza dei farmaci durante il processo di sviluppo farmacologico (DDP) si basano principalmente su tradizionali colture cellulari bidimensionali (2D), considerate troppo semplicistiche e spesso inefficaci, o sperimentazioni su animali, che sono costose e richiedono tempo, e non sono veramente rappresentative delle risposte umane. La traduzione clinica degli attuali modelli preclinici rimane quindi limitata, portando ad alti tassi di fallimento durante gli studi clinici. Il principale fattore di criticità è la tossicità non rilevata, con epatotossicità e cardiotossicità che svolgono un ruolo critico e sono le principali responsabili dei ritiri di farmaci dal mercato correlati alla sicurezza. Questi inconvenienti potrebbero essere superati dalla tecnologia Organs-on-Chip (OoC) recentemente sviluppata. Gli OoC sono sofisticati sistemi in vitro in grado di ricapitolare l'architettura e le funzionalità native degli organi umani. Gli OoC stanno ricevendo una crescente attenzione nel campo del DDP, in particolare per quanto riguarda l'efficacia e la sicurezza dei farmaci. Quando un farmaco viene somministrato nel corpo umano, viene metabolizzato dal fegato e il composto risultante può causare tossicità imprevista su organi fuori bersaglio come il cuore. In questo senso, sono stati adottati diversi modelli di fegato e cuore per valutare la tossicità di farmaci nuovi o ritirati. I recenti progressi nella tecnologia OoC stanno rendendo disponibili piattaforme che comprendono più organi fluidicamente collegati per valutare e prevedere in modo efficiente gli effetti sistemici dei composti. Tali piattaforme Multi-Organs-on-Chip (MOoC) rappresentano una soluzione dirompente per studiare gli effetti correlati ai farmaci su più organi contemporaneamente, il che risulta particolarmente utile per prevedere il metabolismo epatico sui tessuti target e off-target per migliorare in ultima analisi l'efficacia dei farmaci e i test di sicurezza nelle fasi precliniche del DDP. La presente tesi di dottorato mira a sviluppare nuove soluzioni tecnologiche per progettare piattaforme avanzate di coltura cellulare che comprendano il metabolismo epatico per applicazioni di efficacia e sicurezza dei farmaci. Mirando a modellare gli ambienti epatici e cardiaci nativi, l'obiettivo finale è stato la generazione e il test di piattaforme MOoC in vitro 2D e tridimensionali (3D) fisiologicamente rilevanti e funzionali. Verrà prima presentata una tecnica microfluidica per il micropatterning di domini proteici e colture cellulari all'interno di dispositivi OoC. Questo metodo si basa sull'uso di strati di polidimetilsilossano (PDMS) accoppiati con la tecnica di ablazione al plasma per la rimozione selettiva delle proteine. Mostreremo come questa tecnica può essere impiegata per miniaturizzare un modello di fegato in vitro basato su co-colture micropatternate direttamente all'interno di una piattaforma MOoC a doppio compartimento adatta per applicazioni di screening di farmaci basati sulla farmacocinetica e farmacodinamica. Gli effetti del Tegafur, un composto non tossico metabolizzato dal fegato nel 5-Fluorouracile citotossico, sulla linea cellulare del cancro al colon sono stati valutati utilizzando due dispositivi microfluidici in cui i sistemi di microcanali e valvole vengono utilizzati per modellare la diffusione del farmaco tra i compartimenti di coltura. Dopo la conferma della fattibilità tecnica del metodo e della capacità del modello di fegato di metabolizzare i farmaci, tale tecnica è stata quindi adottata per sviluppare una piattaforma MOoC a doppio compartimento comprendente un fegato 2D e un modello di cuore 3D specificamente progettati per test di sicurezza dei farmaci. La somministrazione del farmaco Terfenadine, un composto cardiotossico metabolizzato dal fegato nella non cardiotossica Fexofenadine, ha dimostrato che il metabolismo epatico e un fine controllo della diffusione del farmaco sono fondamentali per suscitare una risposta cardiaca fisiopatologica. Inoltre, in tale piattaforma MOoC, le cellule cardiache possono essere addestrate meccanicamente per ottenere un microtessuto battente, la cui elettrofisiologia può essere registrata direttamente in vitro. Tuttavia, tale modello di fegato è un modello 2D basato su linee cellulari epatiche e pur essendo in grado di metabolizzare in modo efficiente i composti e papabile per test preliminari di efficacia e sicurezza dei farmaci, non può imitare completamente il microambiente epatico nativo. Infatti, il fegato ha un'architettura molto definita in cui le cellule parenchimali (cioè gli epatociti) e non parenchimali (ad esempio le cellule endoteliali) sono separate da un sottile strato di matrice extracellulare (ECM) e si influenzano vicendevolmente mediante interazioni paracrine e di contatto. Per questo motivo, abbiamo ulteriormente sviluppato una tecnica per generare microtessuti epatici 3D vascolarizzati funzionali in vitro che comprendono cellule primarie (ad es. epatociti e cellule endoteliali) dove l'integrazione di un canale cilindrico perfondibile può essere eventualmente sfruttata per studiare meglio la tossicità sistemica dei farmaci metabolizzati dal fegato su organi bersaglio e fuori bersaglio all'interno di una piattaforma MOoC di nuova generazione. Nella presente tesi di dottorato sono state raggiunte novità sia tecniche che biologiche. I progressi comprendono: i) lo sviluppo di una tecnica di patterning proteico microfluidico per generare un modello epatico metabolicamente competente all'interno delle piattaforme MOoC, ii) l'adozione di tale tecnica per valutare funzionalmente l'efficacia e la sicurezza dei farmaci sul bersaglio (cioè tumore) e fuori bersaglio (cioè, cuore) e iii) lo sviluppo di una piattaforma che consenta la generazione efficiente di microtessuti vascolarizzati perfondibili, imitando meglio l'architettura degli organi nativi. Queste piattaforme sono state fondamentali nella creazione di costrutti funzionali del fegato, del tumore e del cuore e possono essere eventualmente sfruttate per ottenere nuove intuizioni biologiche relative alle risposte cellulari quando sottoposte a farmaci metabolizzati dal fegato e/o combinazioni di stimoli fisiologicamente rilevanti all'interno di un dispositivo unico.