Biomimetic peptides initiate hard tissue formation through accelerated and ordered mineralization

Periodontium is a complex tissue made of both soft tissues, namely periodontal ligament and gingiva, and hard tissues, which are root cementum and alveolar bone. Periodontal tissues can be damaged by plaque microorganisms, that are responsible for a dental inflammatory process which can eventually cause periodontitis: this disease leads to tooth mobility, altered mastication and pain; it could also lead to tooth loss. A systematic review of clinical literature revealed that the current therapies for periodontal regeneration have demonstrated good ability to fill defects with soft tissue, meanwhile the bone regeneration is still limited. Hence, there is a need for solutions that can induce mineralization and bone formation. The aim of this thesis is to characterize the mineralization potential of two biomimetic peptides for periodontal regeneration. Given the similarity to the naturally occurring protein amelogenin, which is the major protein constituent of the developing enamel matrix, the synthetic prolin-rich peptides P2 and P6 were chosen for this purpose. In order to investigate how the P2 and P6 peptides are involved in the chemical regulation of mineralization, molecular dynamics simulations were carried out. The results of the simulations were then validated with an experimental model: the peptides were added to a simulated body fluid, i.e., an aqueous solution with a concentration of ions that mimics the human physiological conditions. To evaluate the role of the P2 and P6 peptides in mineralization, a control group (without peptide) was analyzed as well. Moreover, to assess the progression of the mineralization process, different time points were tested, namely 3h, 6h, 12h, 24h and 48h. The pH drop during the process is an indication of mineral precipitation: the pH measurements showed that the P2 and P6 groups gave statistically greater pH drops than the control group up to 12h, which suggests that the peptides could induce accelerated mineralization. However, this has to be confirmed with ICP-MS results, as they provide information on the change of concentration of calcium and phosphate ions during the process. The mineral precipitate morphology was investigated through SEM, TEM and S/TEM: it was observed that both the peptide groups showed a structure with bigger needles and larger flakes with respect to the control group; peptide groups showed sheet-like structures as well. This could be an indication that the peptides can induce also ordered mineralization, which is fundamental to resemble bone and its unique properties. The chemical composition of the precipitate was analyzed with EDS, but there were not clear differences between the groups: indeed, the Ca/P ratio ranged between 1.6 and 1.8, which is in line with the Ca/P ratio of pure hydroxyapatite. These observations suggest that P2 and P6 could be good candidates to induce accelerated and ordered mineralization, and are therefore of interest for periodontal regeneration applications.

Il parodonto è un tessuto complesso costituito sia da tessuti molli (legamento parodontale e gengiva) sia da tessuti duri (cemento radicolare e osso alveolare). I tessuti parodontali possono essere danneggiati dai microorganismi presenti nella placca dentale, responsabili di un processo infiammatorio che può infine causare la parodontite, la quale a sua volta porta a masticazione alterata, dolore e mobilità dei denti, nonché probabile perdita degli stessi. Una revisione sistematica della letteratura clinica ha evidenziato come le terapie attuali per la rigenerazione parodontale abbiano una buona capacità di rigenerazione dei tessuti molli, mentre siano ancora limitate nell’ambito di quella ossea. Di conseguenza, c’è bisogno di soluzioni in grado di indurre la mineralizzazione e la formazione ossea. Lo scopo di questa tesi è di caratterizzare il potenziale di mineralizzazione di due peptidi biomimetici per la rigenerazione parodontale. Data la somiglianza con l’amelogenina, una proteina naturale coinvolta nella mineralizzazione della matrice dello smalto, sono stati scelti due peptidi sintetici ricchi di prolina, P2 e P6. Per capire in che modo i peptidi P2 e P6 siano coinvolti nella regolazione chimica della mineralizzazione ossea, sono state effettuate delle simulazioni di dinamica molecolare. I risultati delle simulazioni sono stati poi validati con un modello sperimentale: i peptidi sono stati aggiunti ad un fluido biologico simulato, cioè ad una soluzione acquosa con una concentrazione di ioni tale da simulare le condizioni fisiologiche umane. Per valutare il ruolo dei peptidi P2 e P6 nella mineralizzazione, è stato analizzato anche un gruppo di controllo (senza peptide). Inoltre, per verificare la progressione del processo di mineralizzazione, sono stati testati diversi punti temporali, cioè 3h, 6h, 12h, 24h e 48h. La riduzione di pH durante il processo è un indice della precipitazione del minerale: le misure del pH hanno dimostrato che i gruppi P2 e P6 generano una riduzione di pH statisticamente maggiore rispetto al gruppo di controllo fino a 12h, il che suggerisce che i peptidi potrebbero indurre una mineralizzazione accelerata. Tuttavia, ciò deve essere confermato con i risultati ICP-MS, dal momento che essi forniscono informazioni sulla variazione di concentrazione degli ioni calcio e fosfato durante il processo. La morfologia del minerale precipitato è stata analizzata attraverso SEM, TEM e S/TEM: è stato osservato che entrambi i peptidi mostrano una struttura con aghi più lunghi e fiocchi più grandi rispetto al gruppo di controllo; i gruppi P2 e P6 mostrano anche delle strutture simili a fogli. Questa può essere un’indicazione del fatto che i peptidi possono indurre anche una mineralizzazione ordinata, fondamentale per assomigliare all’osso e alle sue proprietà uniche. La composizione chimica del precipitato è stata analizzata con EDS, ma non sono presenti chiare differenze tra i gruppi: infatti, il rapporto Ca/P varia tra 1.6 e 1.8, che è in linea con il rapporto Ca/P dell’idrossiapatite pura. Queste osservazioni suggeriscono che i peptidi P2 e P6 potrebbero essere dei buoni candidati per indurre una mineralizzazione accelerata e ordinata, e sono quindi di interesse per applicazioni di rigenerazione parodontale.