Tunable pattening of vascular network for tissue engineering

When a cellularized vascular scaffold is implanted in vivo, it is necessary that it integrates as fast as possible inside the host vascular system in order for cells to survive. This integration can be enhanced if the implant is already prevascularized. Before an in vivo application, in vitro models need to be established. In this thesis, the main aim was the development and the validation of an in vitro model for vasculo-/angiogenesis using an acoustofluidic system. Cells, in particular Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Bone Marrow derived Mesenchymal Stem Cells (BM-MSCs), were patterned into lines inside a photopolymerizable Gelatin-Methacryloyl (GelMA) solution and extruded. In order to do that, a piezoelectric transducer was employed to convert a signal into physical waves inside a squared glass capillary, where the suspension of hydrogel and cells was present. The travelling wave and its reflected wave met in a nodal point, exerting a force on the cells that maintains them in place forming lines. The transition of GelMA from liquid-like to solid-like state due to blue light (405 nm) crosslinking maintain the cells in the fixed position after they do not have the influence of the acoustic field anymore. This method results in a high local cell density and improve the cell-cell interaction, which is important for tissue formation. Cells have been pre-patterned to form a line, facilitating the development of long, continuous and parallel vessels. First, a comparison between patterned and not-patterned samples was performed. The capillaries obtained in the first case showed a structure that is closer to that present in vivo: the vascular network was formed by a main vessel, from which numerous sprouts grown. For every extrusion, a total of four lines were formed, two on the front and two on the back, using a frequency of 1.682 MHz. The supporting role of MSCs has been researched with the use of two different assays: an extruded sample and a spheroid model as control. It appeared that in the absence of this type of cell, Endothelial Cells (ECs) are not be able to form any vascular structure, thus confirming the need for a co-culture for the development of this model. Once the vasculo-/angiogenesis model is established, the next goal was to interface it with a model of tumor to study its influence. In order to do this, cancer spheroids containing HUVECs, BM-MSCs and M.D. Anderson - Metastatic Breast 231 (MDA MB 231) cells were brought into contact with the GelMA fiber using polyethylene glycol (PEG). The influence of the cancerous cells on the preformed vessels was studied in terms of length of vascular network. The analysis showed that the length of the network is reduced in the presence of the tumor. This was not the expected result. In fact, due to the fact that in vivo tumors begin to develop the need for angiogenesis and try to attract new blood vessels to grow larger, longer spouts connecting the two systems were expected. This thesis is divided into 5 chapters. Before presenting the work that has been done, an introductory chapter has been inserted: basic information about blood vessels and cells are provided; articles on acustofluidics, however, have been presented more in detail to better understand its operation. Chapter 2 reports the main aim of this thesis project. Then, in Chapter 3, the material and methods employed for the development of this project are presented. Results are reported, described and discussed extensively in Chapter 4. Finally, in Chapter 5, the conclusions of the work carried out and possible future developments are presented.

Quando un costrutto vascolare cellularizzato viene impiantato in vivo, è necessario che questo si integri il più velocemente possibile all’interno del sistema vascolare ospite in modo che le cellule possano sopravvivere. Questa integrazione è facilitata se l’impianto è già prevascolarizzato. Prima di un’applicazione in vivo, un modello deve essere testato in vitro. In questa tesi, l’obiettivo principale è lo sviluppo e la validazione di un modello in vitro per la vasculo-/angiogenesi mediante l’utilizzo di un sistema acustofluidico. Le cellule, in particolare Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) e Mesenchymal Stem Cells (MSCs) sono state disposte in linee all’interno di gelatina metacrilata (GelMA) fotopolimerizzabile ed estruse. Per fare ciò, tramite l’utilizzo di un trasduttore piezoelettrico, un segnale è stato convertito in onde fisiche all’interno di un capillare di vetro, dove erano presenti la sospensione di idrogelo e cellule. L’onda viaggiante e la sua onda riflessa si incontrano in un punto nodale, esercitando una forza sulle cellule che le blocca in posizione formando linee. La transizione di GelMA dallo stato liquido a quello solido dovuto alla reticolazione con luce blu (lunghezza d’onda = 405 nm) ha permesso il mantenimento delle cellule in posizione anche dopo la cessazione del segnale. Questa procedura ha consentito di ottenere un’elevata densità di cellule locali e di migliorare l’interazione cellula-cellula, la quale è importante per la formazione di tessuti. Le cellule sono state disposte quindi lungo una linea, facilitando lo sviluppo di vasi lunghi, continui e paralleli. La prima ipostesi da validare è stata l’effettiva efficacia del pattern di cellule: un confronto tra campioni con cellule allineate o con cellule distribuite in maniera casuale è stato effettuato. I capillari ottenuti nel primo caso mostrarono una struttura che si avvicina maggiormente a quella presente in vivo: una la rete vascolare formata da un vaso principale, da cui si diramano numerose ramificazioni. Per ogni estrusione, utilizzando una frequenza pari a 1.682 MHz, son state generate un totale di quattro linee, due in primo piano e due in secondo piano. Il ruolo di supporto delle MSCs è stato analizzato utilizzando due saggi differenti: un campione estruso e un modello di sferoide come controllo. In assenza di questa tipologia di cellule, le cellule endoteliali non sono state in grado di formare alcuna struttura vascolare, confermando così la necessità di una co-cultura per lo sviluppo di questo modello. Una volta sviluppato il modello vasculo-/angiogenesi, l’obiettivo seguente è stato l’interfacciamento di quest’ultimo con un modello di tumore per studiarne l’influenza. Per fare questo, sferoidi tumorali sono stati messi in contatto con la fibra di GelMA grazie all’ausilio del polietilen glicole (PEG). L’influenza delle cellule cancerose sui vasi preformati è stata studiata in termini di lunghezza della rete vascolare. Dall’analisi effettuata è risultato che la lunghezza delle strutture vascolari è stata ridotta in presenza del tumore. Questo non era il risultato atteso. Infatti, a causa del fatto che in vivo i tumori tendono a sviluppare nuovi vasi sanguigni e ad attirare a se quelli preesistenti, prolungamenti maggiormente estesi erano attesi. Questa tesi è stata suddivisa in 5 capitoli. Prima di presentare il lavoro svolto, è stato inserito un capitolo introduttivo: vengono fornite informazioni di base sui vasi sanguigni e sulle cellule; articoli sull’acustofluidica, inoltre, vengono presentati in modo più dettagliato per capire meglio il suo funzionamento. Il capitolo 2 illustra gli obbiettivi di questo progetto di tesi. Nel capitolo 3 vengono poi presentati i materiali e i metodi utilizzati per lo sviluppo di questo progetto. I risultati sono illustrati e discussi nel capitolo 4. Infine, nel capitolo 5, sono presentate le conclusioni del lavoro svolto e possibili sviluppi futuri.