3D meat bioprinting : progettazione e sviluppo di uno scaffold per la produzione di carne ingegnerizzata

The goal of this thesis project is the production of a gel, which results suitable for the 3D seeding of fibroblasts, the ink, that will be printed using a 3D printer and will act as a scaffold for a subsequent culture in static conditions. So, we want to verify that the gel allows the survival of the culture in such a way as to be able to use adipose stem cells and satellite cells in the future in a dynamic culture perspective inside a bioreactor. The final goal is to lay the foundations to produce a polymeric blend that allows it to be used in the field of food engineering to produce engineered meat to obtain the finished product bypassing the fiber assembly technologies used. up to this moment and ensuring the absence of potentially toxic degradation residues if ingested. The requirements of this material are ease of obtaining and reproducibility, compliance with printing requirements and the creation of an environment that favors cell adhesion and proliferation. The gel was obtained by dissolving gelatin in distilled water and then adding the mastic. A gel is created separately by adding the alginate inside a second beaker containing distilled water. The two inks are inserted into two different syringes and joined using a luer lock. The final gel is loaded inside a cartridge for 3D printers and various printing tests are carried out to evaluate the quality of the gel, in particular the residence time at room temperature is evaluated such as to allow the gelatin to reach the gel-point, the printing pressure, the shape of the extruded filament and the height development of the scaffold. Once the gel has been obtained, which during the various tests reflects all the required requirements, we proceed by loading the gel with fibroblasts. At the end of the printing, we’ll proceed to cross-link the scaffold through a solution of 0.25 molar CaCl2 which will externally cross-link our construct. Finally, the survival of the cells inside the gel is assessed by leaving it in the incubator for 7 days and carrying out a cell count on days 1, 2 and 7. Various experiments conducted have led to the conclusion that the 5% gelatin + 5% alginate + 1% Chios mastic gel was found to comply with all the required requirements, maintaining good print quality, a development in height of the structure and a low print pressures.

L'obiettivo di questo lavoro di tesi è la produzione di un gel adatto alla semina 3D di fibroblasti, l’inchiostro, il quale sarà stampato tramite stampante 3D fungerà da scaffold per una conseguente coltura in condizioni statiche. Si vuole quindi verificare che il gel permetta la sopravvivenza della coltura in modo tale da poter utilizzare in futuro cellule staminali adipose e cellule satellite in un ottica di coltura dinamica all’interno di un bioreattore. L'intenzione finale è quella di porre le basi per la produzione di un blend polimerico che permetta di essere impiegato nell’ambito del food engineering per la produzione di carne ingegnerizzata, al fine di ottenere il prodotto finito bypassando le tecnologie di assemblaggio di fibre utilizzate sino a questo momento e garantendo l’assenza di residui di degradazione potenzialmente tossici se ingeriti. I requisiti di tale materiale sono la facilità di ottenimento e la riproducibilità, il rispetto dei requisiti di stampa e la realizzare di un ambiente che favorisca l'adesione e la proliferazione cellulare. Il gel è stato ottenuto disciogliendo gelatina in acqua distillata e aggiungendo in seguito il mastice, a parte si crea un gel aggiungendo l’alginato all’interno di un secondo becher contenente acqua distillata. I due inchiostri vengono inseriti all’interno di due siringhe diverse e uniti utilizzando un luer lock. Il gel finale viene caricato all’interno di una cartuccia per stampanti 3D e vengono effettuate varie prove di stampa per valutare la qualità del gel, in particolare si valuta il tempo di permanenza a temperatura ambiente tale da permettere alla gelatina di raggiungere il gel-point, la pressione di stampa, la forma del filamento estruso e lo sviluppo in altezza dello scaffold. Ottenuto il gel che durante le varie prove rispecchia tutti i requisiti richiesti, si procede caricando il gel con fibroblasti e infine al termine della stampa si procede alla reticolazione dello scaffold tramite una soluzione di CaCl2 0,25 molare il quale andrà a reticolare esternamente il nostro costrutto. Viene infine valutata la sopravvivenza delle cellule all’interno del gel lasciandolo in incubatore per 7 giorni ed effettuando una conta cellulare nei giorni 1, 2 e 7. I vari esperimento condotti hanno portato alla conclusione che il gel 5% gelatina + 5 % alginato + 1% mastice di Chios è risultato rispettare tutti i requisiti richiesti, mantenendo una buona qualità di stampa, uno sviluppo in altezza della struttura e una stampa a basse pressioni.