Liver Tissue Engineering: Development of a Vasculature 3D Model and Optimization of a Perfusion Bioreactor

Abstract: Liver diseases, both chronic and acute, are continuing to spread worldwide affecting millions of people every year. If not treated, these can lead to end-stage liver disease which is currently treated with orthotopic transplantation. However, only the 10% of the needs are met according to global statistics. This practice is the actual gold standard treatment but it is heavily affected by a shortage of donor organs and its main drawback is the high mortality and morbidities associated to the life-long immunosuppressive therapy. The situation is worsened by extremely long waiting lists characterized by high mortality and dropout rates highlighting the urgent need of alternative therapeutic solutions. In this framework, regenerative medicine and tissue engineering seem to be the most leading disciplines in developing liver assist devices and in vitro grafts that can be implanted into patients to replace dysfunctional livers. Bioreactors demonstrated a pivotal role in providing chemical and physical cues to seeded scaffolds to promote cell proliferation, differentiation and tissue maturation. This work gives a further insight in the study of the interaction between HLA class I/II double knockout (dKO) human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived hepatocytes with 3D decellularized liver scaffolds having the final aim to generate a “Universal Liver” substitute. Afterwards, the focus moved to the investigation of the complex cellular interplay between the parenchymal compartment, represented by fetal liver organoids (FLOs) post conception week 5 (PCW5), and the endothelial cells, represented by GFP-labelled reset-vascular endothelial cells (R-VECs), in a mouse hepatic acellular matrix. To perform the biological experiments, a perfusion bioreactor was optimized to have better perfusion conditions of the constructs. Moreover, to assess the integrity of the mouse liver vascular tree upon decellularization a 3D model of the vasculature was developed also in perspective to perform future computational fluid dynamics (CFD) simulations to optimize culture conditions. The bioreactor is composed by 3 main components: the main body, the gasket and the lid which are made of polytetrafluoroethylene (PTFE or Teflon®), silicone and polycarbonate (PC) respectively. The parts were manufactured mainly by means of a Computer Numerical Control (CNC) machine and a laser cutter machine. An already established perfusion detergent enzymatic treatment (DET) exploited the portal vein (PV) cannulation to generate a decellularized mouse liver scaffold. Scaffolds showed the absence of nuclei and the preservation of the ECM architecture and main biochemical components of the native organ. By means of contrast agent-based X-ray micro computed tomography (µ-CT) imaging, a 3D model of the decellularized liver scaffold vasculature was developed revealing its integrity. In this way, a new high impact instrument has been developed to perform CFD analysis to have more reliable dynamic cultures doing a further advancement in the biotechnology field of bioreactors. HiPSCs dKO liver organoids (LOs)-derived cells were seeded through PV infusion and the constructs were dynamically cultured in custom-designed bioreactor for 14 days. Histological and immunohistochemistry (IHC) analyses showed an efficient and extensive repopulation and successful hepatocytes maturation which expressed HNF4α, A1AT, ALB, CYP3A4, ZO1 and MRP2. Real Time – quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analyses revealed a higher mature hepatocyte genes (CYP3A4 and HNF4α) expression level in the scaffold culture with respect to the one in Matrigel® in vitro control. FLOs PCW5 and R-VECs underwent to a similar protocol and analyses performed for the hiPSCs dKO LOs. A first fluorescence analysis revealed the re-endothelialisation of the vasculature. The construct showed the co-presence of mature hepatocytes and endothelial cells. It demonstrated the further hepatocytes maturation in comparison with the monoculture of FLOs PCW5 in Matrigel® given by the higher expression level of CYP3A4 and HNF4α genes and lower expression level of AFP gene. These results represent one step towards the generation of an in-lab grown “Universal Liver” and the understanding of the complex cellular interplay in the liver tissue.

Abstract: Le malattie epatiche, sia croniche che acute, continuano a diffondersi in tutto il mondo colpendo milioni di persone ogni anno. Se non trattate, possono portare a malattie epatiche in fase terminale, che attualmente vengono trattate con il trapianto ortotopico. Tuttavia, secondo le statistiche globali, solo il 10% dei bisogni viene soddisfatto. Questa pratica è l'attuale trattamento gold standard, ma è fortemente condizionata dalla carenza di organi da donare e il suo principale svantaggio è l'elevata mortalità e morbilità associata alla terapia immunosoppressiva che dura tutta la vita. La situazione è aggravata da liste d'attesa estremamente lunghe, caratterizzate da alti tassi di mortalità e di abbandono, che evidenziano l'urgente necessità di soluzioni terapeutiche alternative. In questo quadro, la medicina rigenerativa e l'ingegneria tissutale sembrano essere le discipline più all'avanguardia nello sviluppo di dispositivi di assistenza epatica e di innesti in vitro che possono essere impiantati nei pazienti per sostituire i fegati disfunzionali. I bioreattori hanno dimostrato un ruolo fondamentale nel fornire spunti chimici e fisici agli scaffold seminati per promuovere la proliferazione cellulare, la differenziazione e la maturazione dei tessuti. Questo lavoro fornisce un ulteriore approfondimento sullo studio dell'interazione tra epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti umane indotte (hiPSC) HLA di classe I/II a doppia eliminazione (dKO) e scaffold epatici decellularizzati in 3D, con l'obiettivo finale di generare un sostituto del "fegato universale". Successivamente, l'attenzione si è spostata sull'indagine della complessa interazione cellulare tra il compartimento parenchimale, rappresentato da organoidi di fegato fetale (FLOs) dopo la quinta settimana di concepimento (PCW5), e le cellule endoteliali, rappresentate da cellule endoteliali resettate vascolari marcate con GFP (R-VECs), in una matrice acellulare epatica di topo. Per eseguire gli esperimenti biologici, è stato ottimizzato un bioreattore a perfusione per ottenere migliori condizioni di perfusione dei costrutti. Inoltre, per valutare l'integrità dell'albero vascolare del fegato di topo dopo la decellularizzazione, è stato sviluppato un modello 3D della vascolarizzazione anche in prospettiva di eseguire future simulazioni di fluidodinamica computazionale (CFD) per ottimizzare le condizioni di coltura. Il bioreattore è composto da 3 componenti principali: il corpo principale, la guarnizione e il coperchio, realizzati rispettivamente in politetrafluoroetilene (PTFE o Teflon®), silicone e policarbonato (PC). Le parti sono state prodotte principalmente con una macchina a controllo numerico computerizzato (CNC) e una macchina per il taglio laser. Un trattamento enzimatico detergente per perfusione (DET) già consolidato ha sfruttato l'incannulamento della vena porta (PV) per generare uno scaffold di fegato di topo decellularizzato. Gli scaffold hanno mostrato l'assenza di nuclei e la conservazione dell'architettura ECM e dei principali componenti biochimici dell'organo nativo. Grazie all'imaging con microtomografia computerizzata a raggi X (µ-CT) basata su agenti di contrasto, è stato sviluppato un modello 3D della vascolarizzazione dello scaffold epatico decellularizzato, rivelandone l'integrità. In questo modo, è stato sviluppato un nuovo strumento ad alto impatto per eseguire analisi CFD al fine di ottenere colture dinamiche più affidabili, facendo un ulteriore passo avanti nel campo delle biotecnologie dei bioreattori. Le cellule HiPSCs dKO derivate da organoidi epatici (LOs) sono state seminate mediante infusione di PV e i costrutti sono stati coltivati dinamicamente in un bioreattore progettato su misura per 14 giorni. Le analisi istologiche e di immunoistochimica (IHC) hanno mostrato un efficiente ed esteso ripopolamento e un'efficace maturazione degli epatociti che hanno espresso HNF4α, A1AT, ALB, CYP3A4, ZO1 e MRP2. Le analisi con la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) hanno rivelato un livello di espressione dei geni degli epatociti maturi (CYP3A4 e HNF4α) più elevato nella coltura dello scaffold rispetto al controllo in vitro con Matrigel®. I FLO PCW5 e R-VEC sono stati sottoposti a un protocollo simile e alle analisi effettuate per i LO hiPSCs dKO. Una prima analisi di fluorescenza ha rivelato la riendotelializzazione della vascolarizzazione. Il costrutto ha mostrato la compresenza di epatociti maturi e cellule endoteliali. Ha dimostrato l'ulteriore maturazione degli epatociti rispetto alla monocultura di FLOs PCW5 in Matrigel®, grazie al livello di espressione più elevato dei geni CYP3A4 e HNF4α e al livello di espressione più basso del gene AFP. Questi risultati rappresentano un passo avanti verso la generazione di un "fegato universale" coltivato in laboratorio e la comprensione della complessa interazione cellulare nel tessuto epatico.