Optical stimulation of endothelial cells mediated by microstructured conjugated polymer

Nowadays, one of the most ambitious challenges in biomedical engineering is represented by the possibility of manipulating angiogenesis, in order to induce or discourage the growth of blood vessels. Angiogenesis is a complex process, finely regulated by multiple factors. Endothelial cells (EC) represent here the main target. Being able to intervene in a noninvasive and specific way is one of the desired requirements in the treatment of pathologies for the restoration of correct vascularisation. Importantly, the availability of innovative techniques able to selectively trigger, in a spatially and temporally resolved manner, cells and even sub-cellular compartments may open breakthrough perspectives. In this respect, regenerative medicine and tissue engineering tools, as well as therapies based on stem cells, are not considered to be a fully viable and efficient therapeutic approach. Thus, several efforts in the last decade have been focusing towards the development of alternative strategies, able to overcome current limitations. In particular, optical stimulation provides important potential advantages, in terms of invasiveness, resolution, selectivity. Among other possibilities, the use of photoactive organic semiconductors as exogenous transducers was recently proposed. Their distinct advantages comprise excellent biocompatibility, good efficiency, and highly versatile fabrication technology, which allows for the realization of micro- and nanostructured devices. The latter feature may usefully couple optical and mechanical cell stimulation, in synergy, besides offering a tool for the control over migration and proliferation processes, all of them key to therapeutic angiogenesis applications. In this study, we evaluated the effects of optical stimulation mediated by a micro-structured semiconductor polymeric material on endothelial cells morphology and physiology. As a cell model, we selected human endothelial cells from the umbilical vein (HUVEC), while as a photoactive polymer we choose Poly-3-hexylthiophene (P3HT). To investigate the effects of material optical excitation on cell physiology, we carried out fluorescence Ca2+ imaging experiments. Interestingly, we observed significant variation of intracellular Ca2+ concentration respect to control, optically inert samples, both in the case of flat polymer thin films, and in the case of microstructured devices. We provide a tentative interpretation of our results, hypothesizing the action of two different mechanisms at the material/cell interface, namely photothermal and photoelectrochemical transduction, turning into generation of reactive oxygen species (ROS) at non toxic concentration and subsequent TRPV1 cationic channels activation. Subsequently, the influence of the microstructure was quantified by carrying out confocal imaging. We evidence morphological changes both at cellular and nuclear level. The rearrangement of the cytoskeleton of the cells deposited on the polymeric material with micropillar stimulates a remarkable morphological change also in the nucleus, through traction and compression forces transmitted by the actin filaments. Furthermore, a peculiar characteristic of endothelial cells was highlighted: the presence of filopodia. Although a quantitative analysis has not been made at this stage, we can appreciate different characteristics, which suggest the possibility of a direction towards the phenotype, tip cell, typical of the angiogenic sprouting phase. Overall, our results demonstrate that microstructured polymer devices represent a promising strategy for effective optical modulation of ECs. Future studies will be aimed at confirm ing a pro-angiogenic effect, thus paving the way to applications in therapeutic angiogenesis for the treatment of ischemia, myocardial infarction and wound healing.

Ad oggi una delle sfide più ambiziose nell’ingegneria biomedica è rappresentata dalla possibilità di manipolare l’angiogenesi, per poter indurre o sfavorire la crescita di vasi sanguigni. L’angiogenesi è un processo complesso, finemente regolato da molteplici fattori e ha come prin cipale target le cellule endoteliali. Poter intervenire in modo non invasivo e specifico è uno dei requisiti più importanti nel trattamento delle patologie per il ripristino della corretta vascolariz zazione. Di particolare importanza sono le tecniche innovative in grado di stimolare selettivamente, spazialmente e temporalmente, cellule e compartimenti sub-cellulari. La disponibilità di questa tipologia di tecniche può aprire prospettive rivoluzionarie. A questo proposito, la medicina rigenerativa e l’ingegneria tissutale, così come le terapie basate sull’utilizzo di cellule staminali, non sono considerate un approccio terapeutico pienamente praticabile ed efficiente. Pertanto, nell'ultimo decennio diversi sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di strategie alternative, in grado di superare i limiti attuali. In particolare, la stimolazione ottica fornisce importanti potenziali vantaggi, in termini di ridotta invasività, e maggiore risoluzione e selettività. Una recente alternativa è l'uso di semiconduttori organici fotoattivi come trasduttori esogeni. I loro vantaggi comprendono un'eccellente biocompatibilità, una buona efficienza e una tecnologia di fabbricazione altamente versatile, che consente la realizzazione di dispositivi micro-nanostrutturati. Quest'ultima può combinare sinergicamente la stimolazione cellulare ottica e meccanica, oltre ad offrire uno strumento per il controllo dei processi di migrazione e proliferazione. In questo studio, abbiamo valutato gli effetti della stimolazione ottica mediata da un materiale polimerico semiconduttore microstrutturato sulla morfologia e fisiologia delle cellule endoteliali. Per il modello cellulare abbiamo selezionato le cellule endoteliali umane dalla vena ombelicale (HUVEC), mentre come polimero fotoattivo abbiamo scelto Poly-3-hexylthiophene (P3HT). Per studiare gli effetti dell'eccitazione ottica del materiale sulla fisiologia delle cellule, abbiamo effettuato esperimenti di imaging in fluorescenza del Ca2+. Di particolare interesse è stata la variazione significativa della concentrazione intracellulare di Ca2+ rispetto al controllo, ovvero campioni otticamente inerti, sia nel caso di film sottili polimerici piani, sia nel caso di dispositivi microstrutturati. Su questo proposito ipotizziamo l’azione di due diversi meccanismi all'interfaccia materiale/cellula: la trasduzione fototermica e fotoelettrochimica, con conseguente generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) a concentrazioni non tossiche, e la successiva attivazione dei canali cationici TRPV1. Successivamente, è stata quantificata l'influenza della microstruttura effettuando l'imaging confocale. Sono stati individuati cambiamenti morfologici sia a livello cellulare che nucleare. Il riarrangiamento del citoscheletro delle cellule depositate sul materiale polimerico con micropillar stimola un notevole cambiamento morfologico anche nel nucleo, attraverso forze di trazione e compressione trasmesse dai filamenti di actina. Inoltre, è stata evidenziata la presenza di filopodi, una caratteristica peculiare delle cellule endoteliali. Sebbene non sia stata effettuata un'analisi quantitativa su questa parte, è possibile apprezzare la presenza di diverse caratteristiche che suggeriscono la possibilità di indirizzamento cellulare verso uno specifico fenotipo, detto tip cell, tipico della fase di germinazione angiogenica. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che i dispositivi polimerici microstrutturati rappresentano una strategia promettente per un'efficace modulazione ottica delle cellule endoteliali. Studi futuri mireranno a confermare un effetto pro angiogenico, aprendo così la strada ad applicazioni nell'angiogenesi terapeutica per il trattamento dell'ischemia, dell'infarto miocardico e della guarigione delle ferite.