Assessment of peptides specificity for cellular targeting: a fluorescence-based binding assay

The introduction of nucleic acids (NAs) into target cells with the use of polymer or lipid-based delivery vehicles is known as non-viral gene delivery. These types of systems have great advantages, such as low cytotoxic and immunogenic effects, and large cargo capacity. However, non-viral vectors are affected by limited transfection efficiency due also to the low specificity for the cellular target. To enhance the effectiveness of non-viral vectors, recent research works have been focusing on functionalizing existing vectors, especially with targeting peptides. The conjugation of targeting peptides to the delivery system can strongly improve the targeting ability, avoiding NAs transfer to off-target cells. Although the use of peptides for targeting applications represents a very promising strategy in the field of gene delivery, the literature overall lacks a thorough investigation of mechanisms at the basis of the interaction between the peptide of interest and the receptor found on the cell type considered. For this reason, starting from the binding assay procedures found in the literature, this work aims to devise and optimize a straightforward, fluorescence-based protocol that defines the affinity of the considered peptide for the desired cellular target. The procedure was optimized on two peptides and their cellular target: VGVAPGC for smooth muscle cells and CREDVW for endothelial cells. After preliminary assessments of the best experimental conditions, saturation binding assays were performed with the aim of evaluating the specific binding of the beforementioned peptides. The binding analysis demonstrated that the CREDVW peptide shows specificity for endothelial cells, while the VGVAPGC peptide does not have a preferential binding to smooth muscle cells. Overall, these results confirmed the need to first assess the actual selectivity of targeting peptides with a standard binding assay procedure, before using them in gene delivery applications.

L'introduzione di acidi nucleici (NAs) in cellule target con l'utilizzo di sistemi di delivery polimerici o lipidici è nota come gene delivery non virale. Questi tipi di sistemi presentano grandi vantaggi, come bassi effetti citotossici e immunogenici e la possibilità di trasportare una più elevata quantità di NAs rispetto ai vettori virali. Tuttavia, i vettori non virali hanno un'efficienza di trasfezione limitata dovuta anche alla bassa specificità per il target cellulare. Per migliorare l'efficacia dei vettori non virali, recenti lavori di ricerca si sono quindi concentrati sulla funzionalizzazione di vettori esistenti, in particolare con peptidi targeting. La coniugazione di sistema di delivery con questo tipo di peptidi può migliorare notevolmente la capacità di targeting, evitando così il trasferimento di NAs a cellule fuori target. Sebbene l'uso di peptidi targeting rappresenti una strategia molto promettente nel campo del gene delivery, in letteratura manca un'indagine approfondita dei meccanismi alla base dell'interazione tra il peptide di interesse e il recettore presente sul tipo cellulare considerato. Per questo motivo, partendo dai saggi di binding presenti in letteratura, il seguente lavoro si propone di ideare e ottimizzare un protocollo che definisca l'affinità del peptide considerato per il target cellulare, attraverso la quantificazione del segnale di fluorescenza dato dal binding di queste componenti. La procedura è stata ottimizzata su due peptidi e sul loro target cellulare: VGVAPGC per le cellule muscolari lisce e CREDVW per le cellule endoteliali. Dopo una valutazione preliminare per la definizione delle migliori condizioni sperimentali, sono stati eseguiti saggi di saturazione con l'obiettivo di valutare il legame specifico dei peptidi considerati. L'analisi del binding ha dimostrato che il peptide CREDVW mostra una specificità per le cellule endoteliali, mentre il peptide VGVAPGC non ha un legame preferenziale con le cellule muscolari lisce. Complessivamente, questi risultati hanno confermato la necessità di valutare l'effettiva selettività dei peptidi targeting con una procedura di analisi di binding standard, prima di utilizzarli in applicazioni di gene delivery.