Development and optimization of Raman microscopy techniques for the pre-clinical study of osteopetrosis

Osteopetrosis is a genetic pathology normally diagnosed during first months of life, characterized by increased bone density caused by abnormalities in osteoclast development and activity and resulting in bone resorption failure, deformities, and bone fractures. At least eleven different osteopetrosis subtypes are known, associated with different inheritance modalities, prognosis and severity. Osteopetrosis diagnosis and subtyping require complex diagnostic protocols, including bone biopsy, which is an invasive and painful procedure, especially for very young patients. The perspective of using laser light to study this pathology in a non-invasive way is therefore very promising, and can be an opportunity, first, to better understand the etiopathology of osteopetrosis and, second, to potentially allow in vivo diagnosis. In this work we developed and optimized a home-built Raman spectroscopy microscope, and dedicated data calibration and processing software, for the study of osteopetrosis. The results show that one of the main differences between healthy and osteopetrosis bone is hydroxyapatite crystallinity, which is significantly higher (reduced phosphate band width) in osteopetrosis. A significantly higher organic matrix vs apatite ratio has been also detected in pathological samples compared to the normal ones, underlining a bone growth retardation condition in osteopetrosis. Hyperspectral images of bone slices also show an increased bone density, associated with growth retardation in osteopetrosis. In this thesis we used a home-built Raman microscope developed ad-hoc to demonstrate that Raman spectroscopy can be an ideal tool for the direct and non-invasive study of osteopetrosis, opening new research and diagnostic perspectives.

L'osteopetrosi è una malattia genetica tipicamente diagnosticata durante i primi mesi di vita, caratterizzata da un aumento della densità ossea a causa di anomalie nello sviluppo e attività degli osteoclasti, che si traduce nella mancanza di riassorbimento di tessuto osseo, seguita da deformità e fratture ossee. Almeno undici diversi sottotipi di osteopetrosi sono conosciuti, associati a diverse ereditarietà, prognosi e gravità. La diagnosi e sottotipizzazione dell'osteopetrosi richiede protocolli diagnostici complessi, tra i quali la biopsia ossea, una procedura dolorosa ed invasiva, specialmente per i pazienti estremamente giovani. La prospettiva di utilizzare una sorgente di luce laser per lo studio questa malattia in modo non invasivo è quindi molto promettente e potrebbe rappresentare un'opportunità, in primo luogo, per conoscere l'etiopatogenia dell'osteopetrosi e, in secondo luogo, per consentire una diagnosi in vivo. In questo lavoro di tesi abbiamo sviluppato e ottimizzato un sistema di microspettroscopia Raman, con dedicato software per la calibrazione e elaborazione dei dati, al fine di studiare l'osteopetrosi. I risultati mostrano che una delle principali differenze tra osso sano e affetto da osteopetrosi risiede nella cristallinità dell'idrossiapatite, la quale risulta essere significativamente più elevata (minor larghezza di banda del fosfato), nell'osteopetrosi. È stato inoltre osservato un maggior rapporto tra idrossiapatite e matrice organica nei campioni patologici rispetto a quelli sani, che ha sottolinenato una condizione di crescita ossea ritardata nell'osteopetrosi. Le immagini iperspettrali di campioni ossei mostrano inoltre un'accentuata densità ossea associata a un ritardo nella crescita nell'osteopetrosi. In questo lavoro di tesi abbiamo utilizzato un microscopio Raman sviluppato ad-hoc, dimostrando che la spettroscopia Raman può essere uno strumento ideale per uno studio diretto e non invasivo dell'osteopetrosi e aprendo le porte a nuove ricerche e prospettive diagnostiche.