Converging chemical- and cell-based approaches for improved non-viral gene delivery

Non-viral gene delivery strategies have attracted significant interest in the development of novel therapeutic approaches as well as for basic and applied research in vitro. Compared to popular viral vectors, the class of non-viral carriers, namely cationic lipids (CLs) and polymers (CPs) able to spontaneously interact with negatively charged nucleic acids (NAs) to give nanoparticles called complexes, is now witnessing a surge of interest within the scientific community because they are relatively safe, cost-effective, and they can be easily produced and functionalized even at large scale. However, their efficiency in achieving the delivery tasks is still too low to outperform their viral counterparts. The efficacy of non-viral vectors is a tradeoff between their ability to drive NAs into cells, thus allowing/inhibiting their expression, their inherent toxicity, and their ability to deliver genes to target cells. Extensive research effort has thus been put into developing novel ways to improve the efficiency of such a class of delivery systems. In this context, my Ph.D. aimed at developing innovative strategies to improve non-viral vector effectiveness. To this purpose, we dealt with the delivery issue from two different perspectives: on one hand, the modulation of the vector chemistry was disclosed as a way to develop multifunctional carriers with improved effectiveness; on the other hand, we sought to improve cell-(nano)particles’ interactions through the mechanical modulation of the cell behavior in response to the delivery of non-viral vectors. The first part of this thesis was thus aimed at highlighting the importance of vector chemistry on the structure-function relationship of such kinds of materials, with a focus on lipid-based carriers. Furthermore, I dealt with the characterization of a novel class of lipid-based vectors to investigate the interconnection between their structure and ultimate gene transfer ability. This thesis next explored novel ways to improve the performances of polyethyleneimine (PEI), namely the gold standard polymer vector, both in linear (lPEI) and branched (bPEI) topography. First, a thorough investigation of all the experimental variables affecting the performances of PEI-based polyplexes was carried out to disclose the best working conditions of PEI-based carriers and improve the standardization of in vitro screening protocols. Next, I focused on the development of a vector-based approach to functionalize bPEI with targeting moieties to improve the vector’s selectivity towards a specific cell type. We thus synthesized a series of bPEI conjugates incorporating targeting peptides to selectively deliver genes to vascular smooth muscle cells (vSMCs). Moreover, the targeting vectors were incorporated into a polyplex releasing matrix to enable their local and controlled release for cardiovascular-related approaches. Through the conjugation of an elastin-derived peptide sequence to the bPEI structure, we were able to improve the polymer’s effectiveness on target vSMCs while leaving off-target cells unaffected, a fact that is especially relevant for the translation of non-viral gene delivery approaches in vivo. On the other side, a novel strategy based on the regulation of cell response to the delivery of nanoparticles was devised. Indeed, cells in vivo are constantly subjected to different environmental cues that govern some key cell functions. We thus investigated the application of an exogenous mechanical stimulus in terms of vibrational loading to cells undergoing transfection (i.e., the delivery of NAs utilizing non-viral vectors) using lPEI and bPEI-based polyplexes. Interestingly, mechanical stimuli applied to cells improved polyplex internalization by triggering the activation of clathrin-mediated endocytosis (CME), thus leading to greater transfection outcomes. This strategy outlined the importance of cell responses to exogenous cues on the ultimate internalization and expression of a gene of interest and set the stage for a novel way to deal with the non-viral delivery issue. Overall, the big picture drawn by this Ph.D. project highlighted the suitability of chemical-based approaches and cell-based approaches as promising ways to improve non-viral vector effectiveness. Further improvement in non-viral gene delivery research might be achieved by combining the strategies devised in this project. The development of multidisciplinary approaches taking into account both the delivery vector, the environment in which the delivery of genes takes place, and the cell response may thus pave the way to ever more effective strategies, and expedite the translation from the bench to the bedside of these materials.

Negli ultimi decenni, le strategie di veicolazione genica non virale hanno suscitato un notevole interesse per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici e per la ricerca di base e applicata in vitro. Grazie alla loro bassa immunogenicità, facile reperibilità e possibilità di produzione e funzionalizzazione su larga scala, i vettori non-virali, ovvero lipidi (CL) e polimeri cationici (CP) in grado di interagire spontaneamente con gli acidi nucleici (NA) a formare nanoparticelle chiamate complessi, si stanno sostituendo ai più comuni vettori virali per lo sviluppo di strategie di veicolazione genica. Nonostante i presupposti, tali vettori risultano ad oggi ancora poco efficaci e difficilmente traslabili in ambito clinico a causa della loro incapacità a superare le barriere extra- ed intracellulari durante il processo di veicolazione. In generale, l'efficacia di tali vettori è un compromesso tra la loro capacità di veicolare NA all'interno delle cellule al fine di consentirne o inibirne l'espressione (meglio definita come trasfezione), la loro tossicità intrinseca e la capacità di veicolare materiale genetico in cellule target. La ricerca odierna si sta dunque focalizzando sullo sviluppo di nuove strategie atte ad aumentare l’efficacia ed efficienza di queste molecole. In questo contesto, il mio progetto di dottorato si è incentrato sullo sviluppo di strategie innovative per migliorare l'efficacia dei vettori non virali. Per giungere all’obiettivo, ho deciso di affrontare il problema della bassa efficienza di tali vettori da due prospettive differenti: da un lato, parte del lavoro si è focalizzata sulla modifica e funzionalizzazione della struttura chimica del vettore al fine di sviluppare vettori multifunzionali che presentassero una maggiore efficienza di trasfezione; dall'altro, abbiamo cercato di migliorare le interazioni tra la componente cellulare e i complessi attraverso l’applicazione di una stimolazione meccanica in grado di innescare una risposta cellulare. La prima parte di questa tesi è stata quindi finalizzata a evidenziare l'importanza della struttura chimica dei vettori ed il relativo impatto su quella che viene definita relazione struttura-funzione (SAR) di questi tipi di materiali, con un focus particolare sui vettori a base lipidica. Per rimarcare l’importanza della dipendenza delle performance di un vettore dalle sue caratteristiche chimiche, parte del lavoro si è incentrato sulla caratterizzazione di una nuova classe di vettori a base lipidica per studiare l'interconnessione tra la loro struttura e la capacità di trasferimento genico. La tesi ha poi esplorato nuovi modi per migliorare le prestazioni della polietilenimmina (PEI), ovvero il vettore polimerico gold standard. In primo luogo, è stata svolta un’indagine approfondita di tutte le variabili sperimentali che influenzano le prestazioni dei poliplessi a base di PEI, al fine di individuare le migliori condizioni di utilizzo dei vettori a base di PEI e migliorare la standardizzazione dei protocolli di screening in vitro. Una volta ottimizzate le condizioni di trasfezione di complessi a base di polietilenimmina, tale polimero è stato preso in considerazione per lo sviluppo di vettori selettivi verso un determinato tipo cellulare. È stata dunque sintetizzata una nuova classe di vettori PEI funzionalizzati con una sequenza peptidica avente capacità di targeting verso cellule muscolari lisce vascolari (vSMC). Tali vettori sono successivamente stati incorporati in una matrice biopolimerica in grado di controllarne il rilascio, allo scopo di sviluppare strategie efficaci da applicare in situ. La coniugazione di una sequenza peptidica derivata dall'elastina alla struttura del PEI ha leggermente migliorato l'efficacia del polimero in vSMC, lasciando invece inalterati altri tipi cellulari quali le cellule endoteliali (EC). In generale, la strategia si è dimostrata promettente per lo sviluppo di approcci di veicolazione genica selettivi, che potrebbero migliorarne la traslazione in vivo. Il secondo filone di ricerca di questo dottorato si è invece focalizzato sullo sviluppo di una strategia innovativa basata sulla regolazione della risposta cellulare mediante applicazione di stimoli meccanici. Nello specifico, lo studio ha valutato l’effetto dell'applicazione di uno stimolo meccanico esogeno, sotto forma di carico vibrazionale, sulla capacità di cellule di internalizzare complessi a base di PEI. Tale strategia si è dimostrata efficace nel migliorare l’internalizzazione dei poliplessi all’interno di cellule trasfettate mediante l’attivazione di meccanismi di endocitosi mediati da clatrine (CME), portando così a miglioramenti significativi in termini di trasfezione senza alcun effetto citotossico. Tali risultati hanno evidenziato come sia possibile agire sul comportamento cellulare per aumentare l’efficienza di trasfezione di comuni vettori non virali, ed ha posto le basi per lo sviluppo di una nuova modalità di trasfezione non virale. In conclusione, il quadro generale tracciato da questo progetto di dottorato ha evidenziato l'idoneità degli approcci basati sia sulla modifica della struttura chimica di vettori non virali sia sull’applicazione di stimoli meccanici per modulare il comportamento cellulare come strategie promettenti per migliorare l'efficacia di trasfezione in vitro di vettori non virali. Ulteriori miglioramenti potrebbero essere ottenuti combinando le strategie ideate in questo progetto. Lo sviluppo di approcci multidisciplinari che tengano conto sia del vettore di somministrazione, sia dell'ambiente in cui avviene la somministrazione dei geni, sia della risposta delle cellule a stimoli esterni può quindi portare allo sviluppo di strategie sempre più efficaci e accelerare la traslazione clinica di questi materiali.