The investigation of protein corona on different PEGylated nanodiamonds, future and innovative nano-carriers for treatment of solid tumor

Over the past two decades, the increasing cancer mortality and the inherent limitations of conventional treatments have led nanomedicine to develop various therapeutic nanoparticles (NPs), capable of selectively delivering the drug into the tumor site with minimal damage to healthy tissues. Among them, nanodiamonds (NDs), the latest allotropes of carbon, are rapidly emerging as promising drug delivery systems due to their attractive properties such as average crystal size of 5 nm, colloidal stability, tunable surface chemistry and biocompatibility. However, because of their tendency to aggregate, they are subjected to surface modification. In this research, nanodiamonds were covalently functionalized with different grades of M-PEG 5 kDa, a non-ionic and hydrophilic polymer, able to increase the biocompatibility of these nanocarriers. Indeed, PEGylation has influenced the composition of protein corona or biocorona, the layer of proteins adsorbed onto NDs surface, which could play a crucial role in the fate of nanosystem. PEGylated nanodiamonds have also been functionalized with the flavoprotein D-amino acid oxidase (DAAO), a promising enzyme for an anticancer therapy by generating hydrogen peroxide (H2O2), a reactive oxidation species (ROS), only at the tumor site after administration of D-amino acids, present in human at very low concentrations (in the micromolar or submicromolar range). The main aim of this thesis project was to investigate how PEGylation could modulate the enzyme’s activity and stability and the formation of protein corona on NDs, with or without DAAO. To this end, activity and stability assays were performed, incubation with human serum was carried out and elution protocols were used to detach the biocorona proteins from the surface of NDs in order to identify them by mass spectrometry analysis and to evaluate the biocompatibility of nanoparticles.

Negli ultimi due decenni, l'aumento della mortalità per cancro e le limitazioni intrinseche dei trattamenti convenzionali hanno portato la nanomedicina a sviluppare diverse nanoparticelle terapeutiche (NPs), in grado di veicolare selettivamente il farmaco al tessuto tumorale con un danno minimo ai tessuti sani. Tra queste, i nanodiamanti (NDs), i più recenti allotropi del carbonio, stanno rapidamente emergendo come promettenti sistemi di rilascio di farmaci grazie alle loro interessanti proprietà, come la dimensione media dei cristalli di 5 nm, la stabilità colloidale, la chimica di superficie regolabile e la biocompatibilità. Tuttavia, a causa della loro tendenza ad aggregarsi, sono soggetti a modifiche superficiali. Nel presente progetto di ricerca, i nanodiamanti sono stati funzionalizzati covalentemente con diversi gradi di M-PEG 5 kDa, un polimero non ionico e idrofilo, in grado di aumentare la biocompatibilità di questi nanocarrier. Infatti, la PEGilazione ha influenzato la composizione della corona proteica o biocorona, lo strato di proteine adsorbite sulla superficie dei NDs, che potrebbe giocare un ruolo cruciale nel destino del nanosistema. I nanodiamanti PEGilati sono stati anche funzionalizzati con la flavoproteina D-aminoacido ossidasi (DAAO), un enzima promettente per l’impiego in una terapia antitumorale grazie alla capacità di produrre perossido di idrogeno (H2O2), una specie reattiva dell’ossigeno (ROS), solo nel sito tumorale in seguito alla somministrazione di D-aminoacidi, presenti a bassissime concentrazioni (nell’ordine del millimolare) nell’organismo umano. L'obiettivo principale di questo progetto di tesi è stato quello di studiare come la PEGilazione possa modulare sia l’attività che la stabilità dell'enzima e la formazione della corona proteica sui NDs, con o senza DAAO. A tal fine, sono stati eseguiti saggi di attività e stabilità, è stata effettuata l'incubazione con siero umano e sono stati utilizzati protocolli di eluizione per staccare le proteine del biocorona dalla superficie dei NDs al fine di identificarle mediante analisi di spettrometria di massa e, conseguentemente, di valutare la biocompatibilità delle nanoparticelle.