A novel millifluidic model featuring neural cells to investigate molecules involved in the microbiota-gut-brain-axis

The microbiota-gut-brain axis (MGBA) features a bi-directional communication between our gut microbiota and the brain, involving several intermediate players. This connection has a key role in various physiological mechanisms, such as immune response, metabolism and signaling pathways. The alteration of the gut microbiota called dysbiosis could potentially affect even the central nervous system (CNS) through the MGBA. In recent years, a link between the MGBA and chronic neurodegenerative disorders has emerged in the case of Alzheimer’s disease (AD), where neuroinflammation plays a major role. Moreover, neuroinflammation may be pivotal in several other neurodegenerative diseases and usually involves the activation of microglia, brain cells specialized in pro-inflammatory mediators’ production. Animal models present several complexities when studying human AD pathological features. At the same time in vitro brain models responsive to neuroinflammation still need to be improved in terms of reliability and reproducibility. Toward this goal, we present the development of an engineered in vitro brain model, able to include all the major CNS cellular populations (astrocytes, microglia, and neurons) in a three- dimensional (3D) environment. This novel engineered model is based on the use of a Transwell®-like insert, whose membrane allows the compartmentalization of two cell models: the apical 3D co-culture of neuron-like and astrocytes incapsulated into a collagen-based hydrogel, and the basolateral 2D single culture of microglia cells. The cell model as a whole resulted in a 3D interfaced co-culture interconnected brain model that was then challenged with bacteria-derived molecules, such as lipopolysaccharide (LPS) produced by E. Coli a microbiota strain, to trigger an inflammatory response. In order to widen the possible application of the model, we also tested its response with two other bacterial derived molecules relevant for neurodegeneration, namely gingipain and Beta-Methylamino-L-alanine (L-BMAA). The result suggested a remarkable neuroinflammatory effect in response to LPS treatment, with the increase of microglial interleukine-6 (IL-6) cytokine production, while gingipain and L-BMAA showed an evident neurotoxic effect causing the reduction of the cellular viability. Finally, the brain-on-a-chip (BoC) model was assembled by using the MINERVA 2.0 device obtained in our laboratory within the “MINERVA” ERC project (ID 724734), whose major objective was the development of a multiorgan-on-a-chip platform to evaluate the role of gut microbiota on CNS pathophysiology. MINERVA 2.0 device (patent n°WO2021053458A1) is a millifluidic and optically accessible bioreactor, designed and set up to be innovative, modular, versatile, and 3D printable. The 3D interfaced co-culture was housed inside the device to evaluate the cell neuro-response to physiological-like perfusion-derived stimuli. When in dynamic condition, we challenged the BoC with LPS finding, also in this case, a neuroinflammatory response given by the activation of microglia cells. Lastly, since millifluidic in vitro models are governed by multiple parameters, we also developed a computational model able to predict and describe the diffusion of LPS molecules through our system. Our innovative BoC model showed high reproducibility and reliability to be potentially integrated into the MINERVA platform and be implemented with hiPSC- based models towards a patient-personalized BoC.

L'asse microbiota-intestino-cervello (MGBA) rappresenta la comunicazione bidirezionale tra il nostro microbiota intestinale e il cervello, che coinvolge diversi componenti intermedi. Questa connessione ha un ruolo chiave in vari meccanismi fisiologici, come la risposta immunitaria, il metabolismo e le vie di segnalazione. L'alterazione del microbiota intestinale chiamata disbiosi potrebbe potenzialmente colpire anche il sistema nervoso centrale (SNC) attraverso l'MGBA. Negli ultimi anni è emerso un legame tra l’MGBA e i disturbi neurodegenerativi cronici come nel caso della malattia di Alzheimer (AD), in cui la neuroinfiammazione ha un ruolo molto importante. Inoltre, la neuroinfiammazione può essere fondamentale in molte altre malattie neurodegenerative comportando l'attivazione della microglia, l’insieme delle cellule cerebrali specializzate nella produzione di mediatori pro-infiammatori. I modelli animali presentano diverse complessità nello studio delle caratteristiche patologiche dell'AD nell’uomo. Allo stesso tempo, i modelli cerebrali in vitro responsivi alla neuroinfiammazione devono ancora essere migliorati in termini di affidabilità e riproducibilità. A tal fine, presentiamo lo sviluppo di un modello cerebrale ingegnerizzato in vitro, in grado di includere tutte le principali popolazioni cellulari del SNC (astrociti, microglia e neuroni) in un ambiente tridimensionale (3D). Questo nuovo modello ingegnerizzato si basa sull'uso di un inserto Transwell®-like, la cui membrana consente la compartimentazione di due modelli cellulari: la co- coltura 3D apicale di neuroni e astrociti incapsulati in un idrogelo a base di collagene e la singola coltura 2D basolaterale di cellule microgliali. Il modello cellulare nel suo insieme ha prodotto un modello cerebrale di co-coltura 3D interconnesso ed interfacciato che è stato poi testato con molecole derivate da batteri, come il lipopolisaccaride (LPS) prodotto dal ceppo del microbiota E. Coli, per innescare una risposta infiammatoria. Al fine di ampliare la possibile applicazione del modello, abbiamo anche testato la sua risposta con altre due molecole di derivazione batterica rilevanti per la neurodegenerazione, vale a dire gingipaina e Beta-Metilammino-L- alanina (L-BMAA). Il risultato ha evidenziato un notevole effetto neuroinfiammatorio in risposta al trattamento con LPS, con conseguente aumento della produzione della citochina microgliale interleuchina-6 (IL-6), mentre gingipaina e L-BMAA hanno mostrato un evidente effetto neurotossico causando la riduzione della vitalità cellulare. Il modello brain-on-a-chip (BoC) è stato assemblato utilizzando il dispositivo MINERVA 2.0 realizzato nel nostro laboratorio nell'ambito del progetto "MINERVA" ERC (ID 724734), il cui obiettivo principale è lo sviluppo di un multiorgan-on-a-chip per valutare il ruolo del microbiota intestinale sulla fisiopatologia del SNC. Il dispositivo MINERVA 2.0 (brevetto n°WO2021053458A1) è un bioreattore millifluidico otticamente accessibile, progettato e realizzato per essere innovativo, modulare, versatile e stampabile in 3D. La co-coltura interfacciata 3D è stata alloggiata all'interno del dispositivo per valutare la neuro-risposta cellulare a stimoli perfusivi simili alle condizioni fisiologiche. In coltura dinamica, abbiamo testato il BoC con LPS osservando, anche in questo caso, una risposta neuroinfiammatoria data dall'attivazione delle cellule della microglia. Infine, poiché i modelli millifluidici in vitro sono governati da più parametri, abbiamo anche sviluppato un modello computazionale in grado di prevedere e descrivere la diffusione delle molecole di LPS attraverso il nostro sistema. L’innovativo modello di BoC sviluppato ha dimostrato un'elevata riproducibilità e affidabilità per essere potenzialmente integrato nella piattaforma MINERVA e per essere implementato con modelli basati su cellule umane a pluripotenza indotta (hiPSC) verso un modello di BoC personalizzato per il singolo paziente.