Time-resolved multispectral fluorescence microscopy based on computational imaging

Fluorescence is a powerful tool for studying physical, chemical, and biological processes, it is multidimensional (space, spectrum, decay: 4D) and can provide a rich information that allows for high-specificity techniques. However, the high dimensionality leads to longer acquisition times, which may limit its usefulness in biological samples. An efficient strategy to acquire a 4D dataset is single-pixel-camera (SPC), a computational imaging method that can be fruitfully combined with compressive sensing (CS) to reduce the amount of acquisitions while maintaining the information content. In this thesis, a system for fast multidimensional fluorescence microscopy using SPC and CS is proposed, developed, and experimentally validated with measurements on beads and cell samples. 4D datasets were reconstructed from CS acquisitions, using 40% to 90% less measurements compared to a conventional fully sampled imaging. SPC systems typically have the problem of low spatial resolution: this issue is addressed with data fusion, a variational algorithm that allows the SPC dataset to be merged with a high-resolution image acquired with a standard camera, resulting in a higher quality dataset with spectral and temporal information. In addition, a new SPC-based fast fitting algorithm is proposed to allow for a real-time visualization of fluorescence lifetime images during measurement. Fast measurement requires CS, but also short integration times in detection. Hence, part of the work was devoted to the validation of novel high-performance detectors: a multichannel 32x1 SPAD array and a silicon photomultiplier, which are promising for high throughput fluorescence microscopy. The proposed system combined with computational imaging techniques thus results in a flexible framework for fluorescence measurements, aiming at fast measurements for biological applications.

La fluorescenza è un potente strumento per lo studio di processi fisici, chimici e biologici; è multidimensionale (spazio, spettro, decadimento: 4D) ed è molto ricca di informazioni, cioè le tecniche basate sulla fluorescenza hanno elevata specificità. Tuttavia, la multidimensionalità comporta anche tempi di acquisizione più lunghi, che possono limitare l'utilizzo di queste tecniche su campioni biologici. Una strategia efficiente per acquisire un dato 4D è la single-pixel-camera (SPC), un metodo di imaging computazionale basato su un rivelatore puntiforme, che può essere proficuamente combinato con il compressive sensing (CS) e ridurre così il numero di acquisizioni preservando il contenuto informativo. In questa tesi si propone e sviluppa un sistema per la microscopia di fluorescenza multidimensionale veloce che utilizza SPC e CS; il sistema viene caratterizzato e validato sperimentalmente con misurazioni su microsfere di polistirene e su campioni cellulari. Sono stati ricostruiti dati 4D da acquisizioni CS, utilizzando dal 40% al 90% di misure in meno rispetto a un imaging convenzionale completamente campionato. I sistemi SPC hanno tipicamente il problema fornire immagini con bassa risoluzione spaziale: questo aspetto è stato affrontato con la tecnica della fusione dei dati mediante un algoritmo variazionale. Ciò consente di unire i dati misurati mediante SPC con un'immagine ad alta risoluzione acquisita con una telecamera standard, e di ottenere delle immagini di qualità superiore con anche l’informazione spettrale e temporale. Inoltre, viene proposto un nuovo algoritmo di fitting dei decadimenti temporali, basato su SPC, che consente di visualizzare le immagini basate sul tempo di vita della fluorescenza in tempo reale durante la misura. Una misura veloce in fluorescenza richiede l’utilizzo di approcci CS, ma anche l’uso di rivelatori performanti. Per questo motivo, una parte del lavoro è dedicata alla validazione di nuovi rivelatori ad alte prestazioni: uno SPAD multicanale 32x1 e un fotomoltiplicatore al silicio, entrambi molto promettenti per la microscopia di fluorescenza con elevato flusso di dati acquisiti al secondo. Il sistema proposto risulta essere una piattaforma versatile per le misurazioni di fluorescenza e per lo sviluppo di algoritmi computazionali in grado di misurazioni rapide per applicazioni biologiche.