Development of a microfluidic platform to evaluate migration and recruitment of different immune cell types involved in rheumatoid arthritis

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, inflammatory autoimmune disease that can cause irreversible joint damage and significant disability. Joint inflammation in RA is closely related to infiltration of immune cells, among which circulating T-cells and synovial resident macrophages play a critical role. However, the exact mechanism of RA development is still unknown, and it is well established that none of the currently available animal models fully represents human onset and progression. In recent years, microfluidic devices have emerged as a powerful tool for studying cell behavior and interactions in vitro. To this end, an innovative microfluidic device was technically and biologically validated in order to reproduce the active role of immune cells involved in RA, by means of Th1 and Th17 T-cells migration towards activated macrophages. The platform comprises two different culture chambers, one intended for the 3D culture of macrophages in fibrin gel, and one for culture of T-cells in suspension, separated by the presence of "central valves", i. e. normally closed curtain valves, closed at rest and able to put the two compartments in communication, once open through vacuum application. T-cell seeding in the device was possible thanks to a new valve technology, i. e. the "sieving valves", that are normally closed curtain valves, with underneath microgrooves, whose dimensions allow to trap cells within the chamber, as well as to perfuse fluids. After device fabrication through soft-lithography, a technical characterization was done, including the assessment of the valve working mechanisms and of the possibility to form concentration gradients from one chamber to the other. Afterwards, a biological validation was performed to optimize protocols for macrophages activation towards a pro-inflammatory state, T-cell seeding in the de- vice, as well as the experimental plan for the co-culture. Lastly, the platform was biologically qualified analyzing T-cell migration towards activated macrophages recreating known mechanisms of RA. In conclusion, the proposed technology has proven to be a useful tool to study the active role of immune system involved in RA. Future developments will focus on combining the technology with other 3D joint tissue models, i.e. synovial membrane, including macrophage-like and fibroblast-like synoviocytes, getting closer to the real physiology of the joint, aiming at obtaining a deeper understanding about mechanisms involved in RA and paving the way for the investigation of new therapeutic strategies.

L’artrite reumatoide è una malattia autoimmune cronica e infiammatoria che può causare danni irreversibili alle articolazioni e disabilità significative. L’infiammazione articolare è strettamente correlata all’infiltrazione di cellule immunitarie, tra cui i linfociti T e i macrofagi residenti nel sinovio. Tuttavia, l’esatto meccanismo di sviluppo della patologia è ancora sconosciuto ed è ormai assodato che nessuno dei modelli animali attualmente disponibili rappresenta appieno l’insorgenza e la progressione nell’uomo. Negli ultimi anni, i dispositivi microfluidici sono emersi come un potente strumento per studiare il comportamento e le interazioni cellulari in vitro. A tal fine, in questo studio, è stato validato tecnicamente e biologicamente un innovativo dispositivo microfluidico, per riprodurre il ruolo attivo delle cellule immunitarie coinvolte nella malattia, attraverso la migrazione di Th1 e Th17 verso i macrofagi attivati. La piattaforma comprende due diverse camere di coltura, una destinata alla coltura 3D di macrofagi in gel di fibrina, e una per la cultura di cellule T in sospensione, separate dalla presenza di "valvole centrali", chiuse a riposo, in grado di mettere in comunicazione i due compartimenti, una volta aperte, applicando il vuoto. La semina delle cellule T nel dispositivo è stata possibile grazie a una nuova tecnologia di valvole, "sieving valves", anch’esse chiuse a riposo, con microsolchi sottostanti, le cui dimensioni sono tali da fornire una corretta trappola cellulare all’interno della camera, riuscendo comunque a mantenere la perfusione dei fluidi. Dopo la fabbricazione del dispositivo mediante soft-litography, è stata effettuata una caratterizzazione tecnica, tra cui il funzionamento delle valvole e la possibilità di formare gradienti di concentrazione da una camera all’altra. Successivamente è stata eseguita una validazione biologica per ottimizzare i protocolli per l’attivazione dei macrofagi verso uno stato pro-infiammatorio, la semina di cellule T nel dispositivo e il piano sperimentale per la co-cultura. Infine, la piattaforma è stata qualificata biologicamente analizzando la migrazione delle cellule T verso i macrofagi attivati, ricreando i meccanismi noti dell’artrite reumatoide. In conclusione, la tecnologia proposta ha dimostrato di essere uno strumento utile per studiare il ruolo attivo del sistema immunitario coinvolto nella patologia. Gli sviluppi futuri si focalizzeranno sulla combinazione della tecnologia con altri modelli di tessuto articolare in 3D, ad esempio la membrana sinoviale, compresi sinoviociti e fibroblasti, avvicinandosi alla reale fisiologia dell’articolazione, con lo scopo di ottenere una comprensione più approfondita dei meccanismi coinvolti, aprendo infine la strada allo studio di nuove strategie terapeutiche.