pH-responsive fusogenic peptides as non-viral gene delivery vectors : an in vitro and in silico study

Fusogenic peptide-based carriers represent a novel non-viral alternative to classical viral vectors and physical approaches in gene delivery due to their endosomal-disrupting ability, non-immunogenicity, and biocompatibility. In this thesis work, we envisioned three innovative fusogenic peptides (KALA, RALA and HALA2) and characterized the change of their secondary structure upon pH acidification from 7.2 to 5 (mimicking the cytosolic and endosomal environments, respectively) with the aim of shedding more light on how peptide conformational variation affects endosomal escape mechanisms. First, the secondary structure changes (helix-to-coil transitions) of peptides upon a pH change (from 7.2 to 5) were assessed both in vitro via circular dichroism (CD) experiments and in silico through Metadynamics simulations. All three fusogenic peptides exhibited a secondary structure alteration upon pH acidification. Then, the ability of such peptides to bind and complex the nucleic acids (NAs) was successfully evaluated both in silico through CG simulations and in vitro using the SYBR Green I exclusion assay obtaining consistent results between the two approaches. Moreover, DNA-peptide complexes were characterized in terms of size and surface charge using Dynamic Light Scattering and Electrophoretic Light Scattering, respectively. Complexes displayed analogous results at charge ratio (CR) 40. In vitro cytotoxicity experiments proved KALA and RALA severe and mild cytotoxicity, respectively. Interestingly, the cytotoxicity of HALA2 was low-to-negligible in our tested conditions. According in vitro pGL3 transfection experiments, KALA displayed neglectful luciferase expression whereas RALA and HALA2 were discretely effective in delivering pGL3. In conclusion, we successfully characterized three pH-responsive fusogenic peptides and we evaluated their ability as non-viral gene delivery vectors both in vitro and in silico.

Ad oggi, i peptidi fusogenici rappresentano una valida alternativa ai vettori virali e ai metodi fisici negli approcci di gene delivery. La novità di tale approccio risiede nella loro innata capacità di provocare la lisi endosomale, nella loro non immunogenicità e nell’ottima biocompatibilità. In questo lavoro di tesi, ci siamo focalizzati sullo studio di tre peptidi fusogenici presenti in letteratura (KALA, RALA e HALA2) per caratterizzarne i cambiamenti conformazionali a seguito di un’acidificazione del pH da 7.2 a 5 (valori rappresentativi del pH citosolico ed endosomale, rispettivamente). L’obiettivo del lavoro è quello di indagare come tali cambiamenti possano influenzare i meccanismi di endosomal escape. In primo luogo, i cambiamenti di struttura secondaria dei peptidi sono stati valutati a diversi pH (7.2 e 5) sia attraverso esperimenti in vitro di dicroismo circolare che in silico tramite simulazioni di dinamica molecolare (Metadynamics). In tal senso, i tre peptidi hanno mostrato differenze conformazionali in risposta ad una diversa condizione di pH. Successivamente, la capacità di tali peptidi di complessare con acidi nucleici è stata valutata con l’ausilio di simulazioni coarse-grained (CG) e del saggio SYBR Green I. I due approcci hanno mostrato risultati vicendevolmente coerenti. In seguito, i complessi DNA/peptide sono stati caratterizzati in termini di dimensioni e carica superficiale utilizzando rispettivamente esperimenti di Dynamic Light Scattering (DLS) e di Electrophoretic Light Scattering (ELS). I complessi hanno mostrato risultati analoghi in termini di dimensione e carica superficiale ad un rapporto di carica (CR) pari a 40. Tramite gli esperimenti di citotossicità in vitro abbiamo osservato come KALA e RALA risultino citotossici nei confronti della linea cellulare HeLa. Per il peptide HALA2, al contrario, la citotossicità risulta trascurabile in ciascuna delle condizioni da noi testate. Gli esperimenti di trasfezione in vitro con pGL3 hanno permesso di valutare l’efficienza di trasfezione (TE) dei nostri peptidi. Per il peptide KALA, la TE risulta trascurabile. Al contrario, RALA e HALA2 si sono rivelati discretamente efficaci nel veicolare il pGL3 all’interno delle cellule. Per concludere, attraverso il presente lavoro di tesi abbiamo caratterizzato con successo tre sequenze di peptidi fusogenici sensibili al pH e ne abbiamo valutato efficacemente l’impiego come vettori non virali per gene delivery.