In vitro cervicovaginal mucus model as a 3D substrate for microbial growth

The human microbiota plays a crucial role in various physiological processes and is particularly prominent in the mucus-rich environments of the body. Between the different niches, the vaginal one is of particular interest due to its impact on women's and neonates' health. Imbalances in vaginal microbiota can lead to infections and reproductive complications. Cervicovaginal mucus, with its dynamic composition and structure, fulfills important functions throughout a woman's reproductive life, and has a bidirectional relation with the hosted microbiota. However, existing models for studying the vaginal ecosystem have limitations in terms of variability of mucus characteristics or reproducibility. Addressing these challenges is essential for advancing our understanding of this complex environment and developing effective therapeutic interventions. The first aim of this thesis was to validate a novel model of cervicovaginal mucus as a three-dimensional growth substrate for microbial cultivation. The synthetic hydrogel employed is produced in seven formulations, differing for viscoelastic properties and mesh size, mimicking in this way both the ovulatory mucus and the mucus plug of pregnancy. All seven formulations were utilized to cultivate two different microorganisms commonly found in the vaginal microbiota: Enterococcus faecalis, a bacterium, and Candida albicans, a yeast. The results of the hydrogel-based cultures were quantitatively compared to the traditional planktonic culture method. Comparisons were made after 24 and 48 hours of incubation, assessing both initial proliferation capacity and long-term growth sustainability, observing the effects of different mesh size, viscoelasticity, and of the presence or not of a 3D scaffold. From the analysis of the results, it emerged that all seven formulations of the mucus-mimicking substrate proved to be suitable for the in vitro cultivation of E. faecalis and C. albicans. No significant effects of the viscoelastic properties on microbial growth were observed. Instead, the effects of the substrate structure clearly emerged, as a correlation between bacterial proliferation and mesh size was observed. Furthermore, regardless of the mesh size, the presence of a 3D structure influenced the growth of both microorganisms, resulting in outcomes that more closely resembled in vivo situations compared to the planktonic method.

Il microbiota umano svolge un ruolo cruciale in vari processi fisiologici ed è particolarmente presente negli ambienti mucosi del corpo. Tra le diverse nicchie microbiche, l'ambiente vaginale è di particolare interesse per la sua influenza sulla salute delle donne e dei neonati. Squilibri nel microbiota vaginale possono portare a infezioni e complicazioni nel processo riproduttivo. Il muco cervicovaginale, con la sua composizione e struttura dinamiche, svolge importanti funzioni durante l'intero ciclo riproduttivo delle donne e ha una relazione bidirezionale con il microbiota ospitato. Tuttavia, i modelli attuali per lo studio dell'ecosistema vaginale presentano limitazioni in termini di variabilità delle caratteristiche del muco o di riproducibilità. Affrontare queste sfide è essenziale per approfondire la comprensione di questo ambiente complesso e sviluppare interventi terapeutici efficaci. Il primo obiettivo di questa tesi è stato validare un nuovo modello di muco cervicovaginale come substrato di crescita tridimensionale per la coltivazione microbica. L'idrogelo sintetico utilizzato è prodotto in sette formulazioni, differenti per proprietà viscoelastiche e dimensioni dei pori della struttura, mimando così sia il muco ovulatorio che il tappo mucoso della gravidanza. Tutte e sette le formulazioni sono state utilizzate per coltivare due diversi microrganismi comunemente presenti nel microbiota vaginale: Enterococcus faecalis, un batterio, e Candida albicans, un lievito. I risultati delle colture idrogeliche sono stati confrontati quantitativamente con il metodo tradizionale di coltura planctonica. I confronti sono stati effettuati dopo 24 e 48 ore di incubazione, valutando sia la capacità di proliferazione iniziale che la sostenibilità della crescita a lungo termine, osservando gli effetti delle diverse dimensioni dei pori, proprietà viscoelastiche e della presenza o meno di una struttura tridimensionale. Dall'analisi dei risultati è emerso che tutte e sette le formulazioni del substrato mimante il muco si sono dimostrate adatte per la coltivazione in vitro di E. faecalis e C. albicans. Non sono stati osservati effetti significativi delle proprietà viscoelastiche sulla crescita microbica. Al contrario, gli effetti della struttura del substrato sono emersi chiaramente, è infatti stata osservata una correlazione tra la proliferazione batterica e le dimensioni dei pori della struttura. Inoltre, indipendentemente dalle dimensioni dei pori, la presenza di una struttura tridimensionale ha influenzato la crescita di entrambi i microrganismi, ottenendo risultati più simili alle situazioni in vivo rispetto al metodo planctonico.