Sviluppo di un sistema di coltura per l'ingegneria tissutale vascolare e di protocolli per l'endotelizzazione di graft tubolari

Haemodialysis represents the preferential treatment for over two million patients suffering from end-stage renal diseases worldwide. The success of the treatment strictly relies upon the establishment and maintenance of a functional vascular access. The arteriovenous fistula represents the gold standard to this scope. Nevertheless, due to its high failure rate, in the last decades researchers have been developing a new generation of arteriovenous grafts which exploits the approaches of in situ vascular tissue engineering. Notwithstanding the relevant progresses that have been made, many grey areas concerning the phenomena occurring after the implant still remain. As a consequence, studying the biomechanisms responsible for vascular accesses failure is of uttermost importance, in particular through advanced in vitro platforms reproducing physiopathological stimuli. To meet the previously formulated demand, the culture system for tubular grafts which is the object of this manuscript has been developed. The device aims to cellularize and culture vascular grafts in order to investigate the effects of single mechanical stimulations and a combination of them. Given its prototype nature, the first aim of the present thesis is the development and the refinement of some of the culture system features, in terms of its components and its control system. This activity is propaedeutic to the second aim, which consists in the design of experimental protocols to be used in the context of the use of the system in a biologically relevant environment. The development of the system components involves adjustments to progress the system toward a more reliable and versatile version. Instead, the changes regarding the control system consist of the improvement of existing functionalities and the implementation of new ones. The aim of the preliminary biological campaign is the definition of a protocol for endothelial cells seeding on vascular grafts, fundamental for every study on grafts, and the formulation of another preliminary one for the culture of constructs under dynamic conditions. The choice of the dynamic seeding strategy among the ones reported in literature depends also on in silico evaluations. After the writing of an operating manual for the system and the selection of a seeding protocol, the latter is experimentally refined. The biological campaign, conducted at the laboratories of Mario Negri Institute in Bergamo, exploits an all-in-one system specifically manufactured for the purpose.

L’emodialisi rappresenta il trattamento di elezione per più di due milioni di pazienti affetti da patologie renali croniche nel mondo. La buona riuscita del trattamento dipende dalla realizzazione e dal mantenimento di un accesso vascolare funzionale. Il gold standard in questo ambito è la fistula arterovenosa, ma, a causa dell’alto tasso di fallimento di questo approccio, negli ultimi anni si sta studiando una nuova generazione di graft arterovenosi che sfrutta i principi dell’ingegneria dei tessuti vascolari in situ. Nonostante i progressi in questo senso, ancora oggi rimangono tante zone d’ombra relative ai fenomeni che si innescano a seguito dell’impianto. Per questo motivo è di fondamentale importanza studiare approfonditamente i meccanismi che portano al fallimento dell’accesso, in particolare con l’ausilio di piattaforme in vitro in grado di riprodurre le condizioni fisiopatologiche appropriate. Il sistema di coltura per graft tubolari oggetto di questo elaborato è stato sviluppato per rispondere all’esigenza appena espressa. Tale sistema ha lo scopo di cellularizzare e mantenere in coltura graft vascolari, al fine di studiare gli effetti sia di singole sollecitazioni meccaniche sia di una loro combinazione. Trattandosi di una versione prototipale, il primo obiettivo del presente lavoro di tesi consiste nello sviluppo e nell’affinamento di alcune caratteristiche del sistema di coltura, in termini di componenti e sistema di controllo. Questa attività è propedeutica al secondo obiettivo, ovvero la messa a punto di protocolli da applicare in una campagna sperimentale con il sistema svolta in ambiente biologicamente rilevante. Lo sviluppo dei componenti del sistema prevede modifiche volte a farlo progredire a una versione più affidabile. Per quanto riguarda invece il sistema di controllo, da un lato si migliorano le funzionalità preesistenti, dall’altro se ne implementano di nuove. La campagna biologica preliminare ha lo scopo di definire un protocollo per seminare cellule endoteliali su protesi vascolari, operazione imprescindibile per qualsiasi studio su graft, e di impostarne uno preliminare per la coltura in condizioni dinamiche dei costrutti. La scelta della strategia di semina dinamica tra quelle presenti in letteratura viene effettuata anche sulla base di una valutazione in silico. Una volta redatto un manuale di utilizzo del sistema e selezionato un protocollo di semina, lo si affina sperimentalmente. Per la campagna biologica, che viene svolta presso i laboratori dell’Istituto Mario Negri di Bergamo, si sfrutta un sistema all-in-one appositamente realizzato.