Synthesis and conformational analysis of hdantoin-based peptidomimetics

The first and central focus of this research is the design, development, and characterization of a universal peptidomimetic scaffold based on a central hydantoin ring. Peptidomimetics have emerged as promising alternatives to natural peptides, combining the advantages of enhanced stability, bioactivity, and a wide range of applications. The hydantoin-based scaffold was chosen for its potential to mimic the structural and functional properties of peptides while offering increased chemical stability and synthetic versatility. A robust synthetic strategy was devised to efficiently construct the hydantoin-based scaffold. Reaction conditions were optimized to achieve high yields and purity. The successful synthesis of the scaffold was confirmed through rigorous spectroscopic characterization, including nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry (MS). To evaluate the structural and conformational properties of the synthesized peptidomimetic compounds, computational calculations were employed. Molecular modeling techniques, such as molecular dynamics simulations and quantum mechanical calculations, were utilized to predict the ground-state conformations and energetics of the peptidomimetics. The computational models provided valuable insights into the preferred conformations, allowing for a deeper understanding of the structure-activity relationships. Moreover, experimental techniques including NMR spectroscopy (VT-NMR and DMSO titrations), circular dichroism (CD) and Attenuated Total Reflectance Fourier-transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) were employed to characterize the secondary structure, folding patterns, and stability of the peptidomimetics. Solid-state characterization techniques such as X-ray crystallography, provided valuable insights into the three-dimensional structure and packing arrangement of the scaffold. These techniques provided valued information on the conformational preferences, secondary structural elements, and stability profiles of the synthesized compounds. Furthermore, the potential for functionalization was explored to expand the scaffold's versatility and tailor its properties for specific applications. Additional functionalization sites were introduced, allowing for the incorporation of various side chains and moieties. The successful functionalization of the scaffold was confirmed through spectroscopic techniques and analytical methods, demonstrating the attachment of specific functionalities to the hydantoin core. The synthesis of the first examples of potential antimicrobial Hydantoin-based peptidomimetics was achieved, and the preliminary biological tests provided information about the capacity of the scaffold to work in this sense. During a visiting PhD period, a parallel research endeavor focused on the conjugation of a Ruthenium-based cytotoxic anticancer compound with Guanidinoneomycin. Guanidinoneomycin, known for its ability to enhance cellular internalization, was selected as a targeting moiety. The rationale behind this conjugation strategy was to leverage Guanidinoneomycin's propensity to selectively internalize the cytotoxic compound through the heparan sulfate pathway, which is often overexpressed during carcinogenic events. The successful synthesis of the conjugated compound was achieved through a multi-step synthetic approach, which involved functionalizing Guanidinoneomycin with a suitable linker followed by conjugation with the Ruthenium-based cytotoxic compound. Ongoing biological testing, including cellular uptake studies and cytotoxicity assays in cancer cell lines, will assess the efficacy, selectivity, and potential therapeutic applications of this targeted anticancer agent. In addition to the conjugation strategy described above, the thesis also encompasses the design and synthesis of a self-immolative anticancer compound featuring the same conjugation units—cytotoxic compound and Guanidinoneomycin. Although the synthesis of the full compound is still in progress, the self-immolative nature of this compound holds promise for controlled release of the cytotoxic agent within cancer cells, potentially enhancing therapeutic efficacy. Future research will focus on completing the synthesis and evaluating the anticancer activity, selectivity, and self-immolative properties of this innovative compound. In summary, this thesis presents two interconnected research areas. The first part showcases a comprehensive investigation into the design, synthesis, and characterization of a universal peptidomimetic scaffold based on a central hydantoin ring. The successful synthesis and functionalization of the scaffold, supported by computational modeling and experimental techniques, highlight its potential as a versatile platform for the development of peptidomimetic compounds with tailored properties. The second part delves into targeted anticancer therapy, focusing on the conjugation of a Ruthenium-based cytotoxic compound with Guanidinoneomycin for selective internalization through the heparan sulfate pathway. Furthermore, the synthesis of a self-immolative anticancer compound combining the same conjugation units demonstrates the potential for innovative and controlled-release anticancer agents. This research contributes to the field of peptidomimetics, offering new insights and methodologies for the design and synthesis of bioactive molecules with enhanced stability and targeted functionalities, and targeted therapy, paving the way for the development of novel therapeutic strategies with enhanced efficacy.

Il primo e centrale obiettivo di questa ricerca è la progettazione, lo sviluppo e la caratterizzazione di una struttura peptidomimetica universale basata su un anello centrale di idantoina. I peptidomimetici si sono rivelati promettenti alternative ai peptidi naturali, combinando i vantaggi di una maggiore stabilità, bioattività e una vasta gamma di applicazioni. La struttura basata sull'idantoina è stata scelta per il suo potenziale nel mimare le proprietà strutturali e funzionali dei peptidi, offrendo al contempo una maggiore stabilità chimica e versatilità sintetica. È stata ideata una robusta strategia sintetica per costruire efficientemente la struttura basata sull'idantoina. Le condizioni di reazione sono state ottimizzate per ottenere alti rendimenti e purezza. La sintesi della struttura è stata confermata attraverso rigorose caratterizzazioni spettroscopiche, tra cui la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e la spettrometria di massa (MS). Per valutare le proprietà strutturali e conformazionali dei composti peptidomimetici sintetizzati, sono stati impiegati calcoli computazionali. Tecniche di modellazione molecolare, come simulazioni di dinamica molecolare e calcoli quantomeccanici, sono state utilizzate per prevedere le conformazioni e l'energia dello stato fondamentale dei peptidomimetici. I modelli computazionali hanno fornito preziose informazioni sulle conformazioni preferite, consentendo una comprensione più approfondita delle relazioni struttura-attività. Inoltre, sono state impiegate tecniche sperimentali, tra cui la spettroscopia NMR (NMR a temperatura variabile e titolazioni DMSO), il dicroismo circolare (CD) e la spettroscopia infrarossa ad attenuazione totale con trasformata di Fourier (ATR-FTIR), per caratterizzare la struttura secondaria, i pattern di ripiegamento e la stabilità dei peptidomimetici. Tecniche di caratterizzazione allo stato solido, come la cristallografia a raggi X, hanno fornito informazioni preziose sulla struttura tridimensionale e l'arrangiamento del reticolo della struttura. Queste tecniche hanno fornito informazioni rilevanti sulle preferenze conformazionali, gli elementi strutturali secondari e i profili di stabilità dei composti sintetizzati. Inoltre, è stata esplorata la possibilità di funzionalizzazione per ampliare la versatilità della struttura e adattare le sue proprietà a specifiche applicazioni. Sono stati introdotti ulteriori siti di funzionalizzazione, consentendo l'incorporazione di varie catene laterali e gruppi funzionali. La funzionalizzazione della struttura è stata confermata tramite tecniche spettroscopiche e metodi analitici, dimostrando l'attacco di specifiche funzionalità al nucleo di idantoina. È stata realizzata la sintesi dei primi esempi di peptidomimetici a base di idantoina potenzialmente antimicrobici, e i test biologici preliminari hanno fornito informazioni sulla capacità della struttura di agire in questo senso. Durante un periodo di dottorato in visita, un'ulteriore attività di ricerca parallela si è concentrata sulla coniugazione di un composto antitumorale citotossico a base di rutenio con Guanidinoneomicina. La Guanidinoneomicina, nota per la sua capacità di migliorare l'internalizzazione cellulare, è stata selezionata come nucleo di attacco. Il razionale dietro questa strategia di coniugazione era sfruttare la propensione della Guanidinoneomicina ad internalizzare selettivamente il composto citotossico attraverso la via dell'eparansolfato, spesso sovraespressa in eventi cancerogeni. La sintesi del composto coniugato è stata raggiunta attraverso un approccio sintetico a più stadi, che ha coinvolto la funzionalizzazione di Guanidinoneomicina con un legante adeguato seguito dalla coniugazione con il composto citotossico a base di rutenio. Test biologici in corso, compresi studi di internalizzazione cellulare e saggi di citotossicità su linee cellulari tumorali, valuteranno l'efficacia, la selettività e le potenziali applicazioni terapeutiche di questo agente antitumorale mirato. Oltre alla strategia di coniugazione descritta in precedenza, la tesi comprende anche la progettazione e la sintesi di un composto autoimmolativo antitumorale che presenta le stesse unità di coniugazione: composto citotossico e Guanidinoneomicina. Sebbene la sintesi del composto finale sia ancora in corso, la natura autoimmolativa di questo composto offre la promessa di un rilascio controllato dell'agente citotossico all'interno delle cellule tumorali, aumentando potenzialmente l'efficacia terapeutica. Le future ricerche si concentreranno sul completamento della sintesi e sulla valutazione dell'attività antitumorale, della selettività e delle proprietà autoimmolative di questo innovativo composto. In sintesi, questa tesi presenta due aree di ricerca interconnesse. La prima parte illustra un'indagine completa sulla progettazione, sintesi e caratterizzazione di una struttura peptidomimetica universale basata su un anello centrale di idantoina. La sintesi e la funzionalizzazione della struttura, supportate da modellazione computazionale e tecniche sperimentali, ne evidenziano il potenziale come piattaforma versatile per lo sviluppo di composti peptidomimetici con proprietà personalizzate. La seconda parte approfondisce la terapia antitumorale mirata, concentrandosi sulla coniugazione di un composto antitumorale citotossico a base di rutenio con Guanidinoneomicina per l'internalizzazione selettiva attraverso la via dell'eparansolfato. Inoltre, la sintesi di un composto antitumorale autoimmolativo che combina le stesse unità di coniugazione dimostra il potenziale di agenti antitumorali innovativi e a rilascio controllato. Questa ricerca contribuisce al campo dei peptidomimetici, offrendo nuove intuizioni e metodologie per la progettazione e la sintesi di molecole bioattive con stabilità migliorata e funzionalità mirate, nonché alla terapia mirata, aprendo la strada allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche con maggiore efficacia.