Cholangiorcarcinoma-on-chip : development and characterization of a human 3D liver tumor model for personalized medicine

Cholangiocarcinoma (CCA) is a deadly cancer of the biliary epithelium characterized by poor prognosis and limited therapeutic options. Therefore, great efforts are urgently needed to deeper decipher CCA pathophysiological mechanisms to develop new effective therapeutic strategies. Nevertheless, the complexity of the native in vivo cell-cell and cell-immune system interactions has hampered an effective recapitulation of the in vitro human milieu through 2D standard culture systems. Recently, strong efforts were focused on developing Organ-On-Chip (OoC) models as promising tools to potentially recapitulate an in vivo-like 3D environment useful for patient-specific pathological studies. Therefore, this thesis aimed to develop an innovative CCA-on- chip device as a platform for drug screening purposes. The microfluidic device was designed and fabricated at Politecnico of Milano (MI), composed of three microfluidically interconnected channels, while primary CCA cells were isolated from patients surgically resected at Humanitas Clinical and Research Hospital (MI). CCA tumor niche was recapitulated by co-culturing CCA cells and cancer-associated fibroblasts (CAFs) in the device central channel, embedded in a customized collagen/fibrin hydrogel, flanked by an endothelial tubule in one lateral channel, mimicking the presence of an endothelial vessel within the chip. An ad hoc medium ensured the retaining of cell phenotype, morphology and proliferation ability. The device architectural reconstruction, using confocal microscopy, showed the ability of the cells to self-assemble in a physiological-like 3D topology. Moreover, compared to 2D culture systems, a significant increase in the expression of key phenotypic cell markers was highlighted and assessed by qRT-PCR. Diffusion assays at small and large molecules showed the high biocompatibility of this platform and the functional integrity of the endothelial tubule, acting in a size-selective manner. Subsequently, hydrogel mechanical proprieties (e.g., hydraulic permeability, stiffness) were evaluated, revealing that the tumor niche undergoes a deep extracellular matrix remodeling overtime in culture, due to the extensive and bidirectional crosstalk established between CCA cells and CAFs within the device. Indeed, scanning electron microscopy (SEM) allowed to verify the reduction of the hydrogel porosity, and ii immunofluorescence assay revealed a significant increase in the collagen IV deposition within the hydrogel, only when tumor cells were co-cultured with CAFs. Finally, Gemcitabine and Cisplatin, the standard of care for CCA patients, were tested on the device. The results assessed the increased resistance in the device to conventional treatments of CCA cells co-cultured with CAFs when compared to the 2D monolayer culture and the 3D tumor cell mono-culture, suggesting its ability to more accurately predict the in vivo drug response. In conclusion, results showed that our CCA-on-chip provides a reliable 3D platform able to faithfully mirror the in vivo CCA microenvironment and may represent a useful tool paving the way for personalized medicine.

Il Colangiocarcinoma (CCA) è un tumore primitivo del fegato, che origina dai dotti biliari ed è caratterizzato da una prognosi sfavorevole e limitate opzioni terapeutiche. Questo rende impellente la necessità di comprendere maggiormente i meccanismi fisiopatologici della neoplasia per poter sviluppare nuove e più efficaci strategie terapeutiche. Tuttavia, la complessità delle interazioni che si osservano in vivo (cellula-cellula e cellula-sistema immunitario) non ha permesso un'efficace ricostruzione del microambiente umano in vitro utilizzando i sistemi standard di coltura in 2D. Negli ultimi anni, molti studi sono stati incentrati sulla tecnologia degli Organ-On-Chip (OoC) come modelli promettenti, in grado di poter mimare meglio il microambiente 3D che si osserva in vivo e quindi utilizzabili per studi patologici costruiti ad hoc per il paziente. Pertanto, lo scopo di questa tesi è stato quello di sviluppare un innovativo dispositivo di CCA-on-chip come piattaforma utilizzabile per screening farmacologici. Il dispositivo microfluidico è stato progettato e fabbricato presso il Politecnico di Milano (MI), ed è composto da tre canali microfluidicamente interconnessi. Le cellule primarie di CCA sono state isolate da pazienti sottoposti a resezione chirurgica presso l’Istituto Clinico Humanitas (MI). Il microambiente tumorale di CCA è stato mimato attraverso la co-coltura di cellule tumorali e fibroblasti associati al cancro (CAFs), incorporati in un gel di collagene e fibrina nel canale centrale del chip. Inoltre, in uno dei canali laterali, sono state seminate delle cellule endoteliali per rappresentare un vaso endoteliale all'interno del chip. Ulteriormente, è stato messo a punto un terreno di coltura, in grado di garantire il mantenimento di ogni fenotipo cellulare e della loro capacità proliferativa. La ricostruzione architettonica del chip, mediante microscopia confocale, ha permesso di visualizzare che le cellule ricreavano una topologia 3D simile a quella fisiologica. Inoltre i tre tipi cellulari mostravano un significativo incremento dell'espressione dei loro principali marcatori fenotipici, valutati mediante qRT-PCR, rispetto alla cultura 2D convenzionale. I saggi di diffusione per molecole di piccole e grandi dimensioni hanno mostrato una elevata biocompatibilità di questa piattaforma e la funzionalità del tubulo endoteliale, che agiva in modo selettivo, in v base alla dimensione delle molecole. Successivamente, le proprietà meccaniche dell'idrogel (es. permeabilità idraulica e rigidità) sono state valutate, rivelando che il microambiente tumorale subiva un profondo rimodellamento a livello della matrice extracellulare durante il tempo di cultura, dovuto all'ampia e bidirezionale interazione che si stabiliva tra cellule tumorali e CAFs all'interno del chip. Infatti, la microscopia elettronica a scansione (SEM) ha permesso di verificare la riduzione della porosità del gel nel tempo, mentre l’analisi tramite immunofluorescenza ha rivelato un significativo aumento della deposizione di collagene IV all'interno del gel, evidente solo quando le cellule tumorali erano in co-cultura con i CAFs. Infine, sono stati effettuati dei test farmacologici con Gemcitabina e Cisplatino, che rappresentano lo standard di cura per i pazienti con CCA. I risultati hanno mostrato una maggiore resistenza delle cellule tumorali in co-cultura con i CAFs ai trattamenti convenzionali nel dispositivo, rispetto alla coltura 2D in monostrato e alla monocoltura delle cellule tumorali in 3D, suggerendo la capacità del chip di poter meglio mimare la risposta farmacologica che si osserva in vivo. In conclusione, i risultati hanno rivelato che il nostro modello di CCA-on-chip fornisce una piattaforma 3D affidabile, in grado di rispecchiare fedelmente il microambiente in vivo del CCA e può rappresentare un strumento utile per aprire la strada ad una medicina personalizzata.