Peptide based technologies for extracellular vesicles analysis

Extracellular Vesicles (EVs) are cell-derived membranous structures ubiquitously found in all biological fluids that have been only recently unrevealed as fundamental players in intercellular communication1. Lying at the cross-roads of biology and nanoscience, EVs are progressively being acknowledged as the new frontier nanoparticles. Yet, many aspects underlining their biological roles remain mostly unexplored due to severe limitations that plague current EV isolation and characterization protocols. Due to the complex nature of biological sample matrices of origin and the physicochemical properties of EVs, accurate and reproducible isolation of EVs still poses significant and mostly unmet challenges, particularly towards the prospective of routinely EVs-based analytical workflows. In this direction, microarrays represent a useful platform for the analysis of extracellular vesicles. This technology allows different simultaneous analysis, low volume consumption of the samples, and high sensitivity. In this technology, peptides have been largely investigated as valuable alternative probes to antibodies, particularly in the immunodiagnostic field, thank to their low cost, stability, synthetic versatility, and tunability of functional groups. In this thesis work, we set to develop different approaches for the use of peptides in the microarray technology propaedeutic to EVs analysis. In the first case, we present the use of membrane-sensing peptides (MSP) as new effective ligands for directly integrating extracellular vesicles (EVs) isolation and analysis on different microarray platforms. In summary, we could show that MSP operate as generic yet selective EVs baits and display higher binding capacity than commonly used anti-tetraspanin antibodies. Based on the membrane sensing properties of a precursor sequence derived from Bradykinin protein, we performed molecular design that led to the generation of a small library of peptides. In particular, the sequences were developed based on their electrostatic and hydrophobic interactions with the phospholipid membrane of EVs. These molecular probes have been evaluated and compared with each other through tests to capture extracellular vesicles on microarray platform. The results showed that, in addition to a first purely electrostatic approach with the membrane, the presence of hydrophobic anchors within the peptide sequence plays an important role in capturing of these biological nanoparticles. Another aim of the thesis was the synthesis of a reference material for the standardization of our platform. For this reason, we investigate a new approach for the production of synthetic extracellular vesicles (synEVs). Bottom-up manufacturing processes use small molecules as the foundational building blocks to create huge, complex structures through a methodical assembling process that combines their physical and chemical features. Specific lipids, ranging from conventional formulations to replicating the makeup of extracellular vesicles, are employed to produce a lipid bilayer before being modified with chemical groups or designed with surface proteins to replicate the structure of natural EVs. As a result, comprehensive knowledge of the roles played by important natural EVs components is necessary for bottom-up approaches. Artificial extracellular vesicles can be pure in composition and have tunable properties by assembling desired components learned from natural EVs. In the second approach, we focused on the use of peptides in the field of hydrogel 3D microarrays. Hydrogels represent ideal semi-wet systems, as biomolecules can be gently confined within a native-like environment, preserving their structural and functional properties. Hydrogel based immobilization platforms can indeed provide highly versatile systems for the fabrication of functional bio-interfaces on diverse analytical formats: from multi-well plates to microarrays slides. However, some hydrogel properties still limit their widespread use for the creation of bioassays. Herein, we developed a composite hydrogel obtained by mixing a self-assembling peptide with low-temperature gelling agarose. In this approach, agarose represent the core structural component while the presence of peptide is crucial to balance out the rheological properties and the introduction of biofunctionalization. We show the viability of our 3D approach in real applications by profiling the serum IgG immunoreactivity of Covid-19 patients, which displayed a markedly better signal-to-noise ratio over conventional assays in the 2D format and exceptional specificity. Finally, we demonstrate the proof-of-concept use of our hydrogel for the physical confinement of EVs under controlled permeability conditions and its use as a platform for the prognostic value of extracellular vesicles as potential biomarkers of bladder cancer.

Le vescicole extracellulari (EVs) sono strutture derivanti dalla membrana cellulare di molte tipologie di cellule e presenti nella maggior parte dei fluidi biologici che soltanto recentemente hanno visto riconoscersi un ruolo fondamentale nella comunicazione cellulare. Tuttavia, molti aspetti che sottolineano i loro ruoli biologici rimangono per lo più inesplorati a causa delle gravi limitazioni presenti negli attuali protocolli di isolamento e caratterizzazione. Vista la loro complessa natura, l'isolamento accurato e riproducibile delle EVs pone ancora sfide significative e per lo più insoddisfatte. In questa direzione, i microarrays rappresentano una piattaforma utile per la loro analisi. Questa tecnologia permette di condurre più analisi simultaneamente, un basso consumo di campioni ed una elevata sensibilità. L’utilizzo di peptidi con questa tecnologia è stato studiato come valida alternativa agli anticorpi, specialmente nel campo immunodiagnostico, grazie al loro basso costo, alla loro stabilità e versatilità sintetica. In questo progetto di dottorato, sono stati sviluppati differenti approcci per l’utilizzo di microarray a peptidi per l’analisi di vescicole extracellulari. Nella prima parte della tesi, la ricerca si è focalizzata sull’utilizzo di peptidi in grado di riconoscere la membrane delle EVs come nuove sonde per il loro l’isolamento e l’analisi su differenti piattaforme microarray. Basandosi su un peptide precursore derivante dalla proteina Bradichinica, è stato effettuato un design molecolare che ha condotto alla generazione di una libreria di peptidi con proprietà di riconoscimento di membrana. In particolare, le sequenze sono state sviluppate sulla base delle loro interazioni elettrostatiche e idrofobiche con la membrana fosfolipidica. I risultati hanno mostrato che, oltre a un primo approccio puramente elettrostatico con la membrana, la presenza di ancore idrofobe all'interno della sequenza del peptide svolge un ruolo importante nella cattura di queste nanoparticelle biologiche. Un secondo lavoro si è orientato sullo studio di un approccio bottom-up per la sintesi di vescicole extracellulari sintetiche come materiale di riferimento per la nostra piattaforma microarray. L’approccio bottom-up si basa sull’utilizzo di semplici molecole come elementi fondamentali per la creazione di strutture più complesse attraverso un processo di assemblaggio metodico che combina le loro caratteristiche chimico - fisiche. Lipidi specifici sono stati impiegati per produrre il doppio strato fosfolipidico poi successivamente modificato con gruppi chimici o proteine di superficie per replicare la struttura delle EV naturali. Di conseguenza, una conoscenza completa delle componenti delle EV è necessaria per questo tipo di approccio. Questa metodologia per la produzione di vescicole extracellulari artificiali conduce alla generazione di particelle pure nella composizione e con proprietà modulabili. Nell’ultima parte del progetto, la studio si è focalizzato sull’utilizzo di peptidi per 3D hydrogel microarray. Gli hydrogel rappresentano sistemi ideali in cui le biomolecole possono essere confinate preservando le loro proprietà funzionali e strutturali. Infatti, le piattaforme di immobilizzazione basate su hydrogel possono fornire sistemi altamente versatili per la realizzazione di bio-interfacce funzionali in diversi formati analitici: dai multi-well ai microarrays. Tuttavia, alcune proprietà degli hydrogel limitano ancora il loro utilizzo per saggi biologici. In questo progetto è stato sviluppato un hydrogel composito ottenuto mescolando un peptide auto-assemblante ed agarosio, un gelificante a bassa temperatura. In questo materiale, l'agarosio rappresenta il nucleo strutturale mentre la presenza di peptide è cruciale per bilanciare le proprietà reologiche e permettere una bio-funzionalizzazione del materiale. Una migliore sensibilità rispetto ad un formato 2D è stata dimostrata profilando l'immunoreattività IgG sierica di pazienti affetti da Covid-19 così come la possibilità di utilizzare l’hydrogel per il confinamento fisico delle EVs, in condizioni di permeabilità controllata. Infine, è stato dimostrato l’uso dell’hydrogel come piattaforma per il valore prognostico delle vescicole extracellulari come potenziali biomarcatori del tumore alla vescica.