Caratterizzazione meccanica di trachee e aorte: dal tessuto nativo al tessuto ingegnerizzato stampato 3D

Regenerative Medicine and Tissue Engineering aim to overcome the current limits of the traditional medicine exploiting cutting-edge techniques such as native tissue decellularization and 3D-bioprinting. In some cases, the techniques are combined. Specifically, the aim is to go beyond the two most serious issues which afflict organs transplantation and tissues substitution, i.e., poor availability of donor organs and the problem of immunological response. The main goal of this work regards the characterization of porcine trachea and aorta’s native and decellularized tissues to verify the preservation of mechanical properties through the comparison of measured parameters. Afterwards, the same characterization and analysis are performed on 3D-printed constructs designed to reproduce the native tissue. The project is developed starting from the initial decellularization of the samples made through three different protocols which exploit different physical, chemical and enzymatical agents. The second step is the mechanical characterization of the tissues by using tensile tests. This allows to obtain relevant parameters such as the elastic modulus, the final elongation, and the ultimate stress. These parameters are computed starting from geometrical values of the tissues that are directly measured by using the gauge or Imagej software. Mechanical testing involves the preparation of ring samples uniaxially stressed in circumferential direction. In only one case, the test is performed on strip samples uniaxially stressed at the two extremities. Each tensile test is preceded by a certain number of preconditioning cycles depending on the characteristics of the considered tissue. A statistical analysis is necessary to evaluate the results, the Student Test (T test) is especially used. Thanks to the evaluation of the p-values, it is possible to compare the properties of native and decellularized specimens. As final step, 3D-printed vessels are tested with the same mechanical test run on the aortas. The vessels are obtained following the geometry and the dimensions of the native aortic tissue, by means of the extrusion printing of an ink composed of alginate and gelatine. In some constructs the extracellular matrix powder produced from the previously processed aortas samples (decellularization, lyophilization and enzymatical digestion) is added to the printable ink. The calculated parameters of the two different kinds of printing are compared according to the same steps of the earlier statistical analysis. Moreover, the mechanical response of the printed vessels immersed in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco™, United Kingdom) after four hours is evaluated. The main goal is to ensure the printing of a scaffold with pdECM that has characteristics as close as possible to those of the native biological tissue.

La Medicina Rigenerativa e l’Ingegneria dei Tessuti mirano a superare gli attuali limiti della medicina tradizionale sfruttando tecniche all’avanguardia come la decellularizzazione dei tessuti nativi o la tecnica della stampa 3D, in alcuni casi, combinate tra loro. In particolare, si vogliono oltrepassare le due problematiche più gravi che affliggono il trapianto di organi e la sostituzione di tessuti, ovvero la scarsa disponibilità di organi donatori ed il problema della risposta immunologica. In questo contesto si inserisce il seguente lavoro di Tesi Magistrale che ha come obiettivo la caratterizzazione di tessuti nativi e decellularizzati di trachea ed aorta per verificare il mantenimento delle proprietà meccaniche attraverso un confronto dei parametri misurati. Successivamente, la stessa caratterizzazione ed analisi viene eseguita su costrutti stampati 3D volti a riprodurre il tessuto nativo. Il progetto si sviluppa partendo da un’iniziale decellularizzazione dei campioni, effettuata attraverso tre protocolli differenti che sfruttano diversi agenti fisici, chimici ed enzimatici. Il secondo passo è la caratterizzazione vera e propria dei provini che, tramite prove a trazione, permette di ottenere parametri rilevanti quali il modulo elastico, l’allungamento e lo sforzo a rottura, partendo da valori geometrici calcolati direttamente attraverso il calibro o attraverso il software Imagej. Le prove meccaniche prevedono la preparazione di provini ad anello trazionati uniassialmente in direzione circonferenziale e, in un solo caso, provini a strisce trazionati uniassialmente dalle due estremità. Ogni prova a trazione viene preceduta da un numero di cicli di precondizionamento dipendenti dalle caratteristiche del tessuto preso in considerazione. Per valutare i risultati è necessario affidarsi ad un’analisi statistica e, nello specifico, all’uso del test di Student (T test). Grazie ai valori di p-value calcolati dal test è possibile confrontare le proprietà dei campioni nativi con quelli decellularizzati. Come ultimo passaggio, i vasi stampati 3D sono sottoposti allo stesso tipo di prova meccanica eseguita sulle aorte. I vasi vengono realizzati, seguendo la geometria e le dimensioni del tessuto aortico, tramite stampa ad estrusione partendo da un inchiostro composto da alginato e gelatina; per alcuni vasi viene aggiunta polvere di matrice decellularizzata ottenuta dai campioni di aorta precedentemente processati (decellularizzazione, liofilizzazione e digestione enzimatica). I parametri calcolati per i due diversi tipi di stampa vengono confrontati tra loro eseguendo gli stessi passaggi dell’analisi statistica precedente. Inoltre, viene valutata la risposta meccanica dei vasi stampati dopo essere stati immersi quattro ore in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Gibco™, United Kingdom). Si vuole quindi garantire la stampa di uno scaffold in cui è presente polvere di matrice decellularizzata (pdECM) che mostri caratteristiche il più possibile simili a quelle del tessuto biologico nativo.