Development and characterization of a 3D in vitro model to study dermal fibroblasts response to hyperosmotic stresses

Skin dermis is primarily composed of extracellular matrix that mediates cellular mechanotransduction of external stresses. Dermal fibroblasts are continuously exposed to different stresses, in both physiological and pathological conditions. Primary mechanical stresses, such as compression, tension, and shear forces, can induce local changes in tissue hydration, leading to variations in the distribution of extracellular hydrostatic and osmotic pressure. Skin fibroblasts are able to sense and transduce these forces, activating specific cellular responses to maintain tissue homeostasis. However, some skin diseases lead to altered stimulations, such a hyperosmotic extracellular environment, which can trigger impaired cell cycle, senescence, and apoptosis. As the extracellular environment highly affects the mechanotransduction of these stresses, we need advanced 3D cell culture systems that replicate some features of the biological environment to better study these phenomena. This is because 2D cultures often fail to simulate the in vivo condition and cause cells to express an artificial phenotype. This work aims to develop robust 3D cell-laden hydrogels of both poly(ethylene glycol) (PEG) and gelatin methacrylate (GelMA) to investigate the response of dermal fibroblasts to extracellular hyperosmotic stresses in comparison to standard 2D cultures. Hyperosmolality was induced in both 2D and 3D cultures by sorbitol solution, and the cellular response was evaluated by analyzing protein levels and gene expression, as well as through fluorescence microscopy. Additionally, the mechanical properties of the hydrogels were characterized to assess the relevance of 3D models in studying the biological response to hyperosmolality. The results of this study suggested that although the activation of the osmoresponsive p38 protein pathway is conserved in different extracellular contexts, there are significant differences in the regulation of genes involved in the osmotic response. These findings highlighted the critical role played by the presence of a biomimetic 3D matrix in the regulation of dermal fibroblasts behavior under external osmotic pressure. Further research is required to explore the potential factors that influence these variations in mechanotransduction and to improve our understanding of the biological response of skin fibroblasts to hyperosmotic stresses.

Il derma della cute è principalmente costituito da matrice extracellulare che media la meccanotrasduzione di stimoli esterni. I fibroblasti all'interno derma sono continuamente esposti a stress di varia natura, sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Gli stimoli meccanici primari, come compressione, tensione e sforzi di taglio, possono indurre cambiamenti nell'idratazione locale del tessuto, causando variazioni nella distribuzione delle pressioni idrostatica e osmotica a livello extracellulare. I fibroblasti sono in grado di percepire e trasdurre queste forze, attivando specifiche risposte biologiche per mantenere l'omeostasi del tessuto. Tuttavia, alcune malattie della cute inducono stimolazioni alterate, come un ambiente extracellulare iperosmotico, che possono innescare l'arresto del ciclo cellulare, senescenza e apoptosi. Poiché l'ambiente extracellulare influenza la meccanotrasduzione di questi stimoli, sistemi di coltura cellulare 3D che mimano le caratteristiche dell'ambiente biologico sono necessari per studiare meglio questi fenomeni. Infatti, le colture 2D spesso non riescono a simulare le condizioni in vivo e inducono l'espressione di fenotipi cellulari artificiali. Questo lavoro mira a sviluppare robusti idrogeli 3D, in polietilenglicole (PEG) o in gelatina metacrilata (GelMA), caricati con cellule, per indagare la risposta cellulare in condizioni iperosmotiche e confrontarla con le colture 2D. L'iperosmolalità è stata indotta nelle colture 2D e 3D mediante soluzione di sorbitolo, mentre la risposta cellulare è stata valutata analizzando i livelli proteici e l'espressione genica, e tramite microscopia a fluorescenza. Inoltre, le proprietà meccaniche degli idrogeli sono state caratterizzate per valutare la rilevanza dei modelli 3D per studiare la risposta biologica all'iperosmolalità. I risultati di questo studio suggeriscono che, nonostante l'attivazione del pathway della proteina osmoresponsiva p38 sia conservata in diversi contesti extracellulari, ci sono significative differenze nella regolazione dei geni coinvolti nella risposta osmotica. Questi risultati evidenziano il ruolo critico svolto dalla presenza di una matrice 3D biomimetica nella mediazione del comportamento dei fibroblasti del derma sottoposti a pressione osmotica esterna. Ulteriore ricerca è necessaria per esplorare i potenziali fattori che influenzano queste variazioni nella meccanotrasduzione e per migliorare la comprensione della risposta biologica dei fibroblasti indotta da stress iperosmotici.