Focusing on the polyplex stability through amine-phosphate binding: from quaternized dextrin to polyethyleneimine

The efficient delivery of genetic material into living cells by non-viral vectors, a process called transfection, is gaining increasing attention because of their safety, in terms of cytotoxic and immunogenic effects, and transport capacity. The aim of this thesis work is two-fold: i) on the one hand, we evaluated the performance of a pretty new cationic polymer, namely quaternized dextrin (QD), synthesized by Prof. Jaiswal’s team at the Indian Institute of Mandi, as a gene delivery vector; ii) on the other hand, we studied the role of different amine groups of cationic polymers on the complexation of nucleic acids (NAs), and overall transfection efficiency (TE). Characterization tests of QD-based complexes showed that they were highly unstable when resuspended in the different culture media typically used in transfection experiments, as they were destabilized by serum proteins. This is in sharp contrast to what has been reported in the literature. As a result of this discrepancy, we sought to shed more light on this instability, so we investigated whether the quaternary amine group of QD affected the complexation ability and binding stability between amines and NA phosphates. Further, we sought to out whether there were differences in the interaction strength between the various amine groups and the NA phosphates. We thus evaluated complex stability through fluorescence assays and using a newly developed assay relying on the influence of the temperature on the polyplex bonds. This allowed us to gain new insights into the polyplex stability, which does not strictly depend on the type of polymer amine rather on the nature of the polymer itself. Overall, the efficiency of a given non-viral polymeric vector does not rely on its cationicity only, rather the binding strength between amines and NA phosphates plays a key role on the overall performances of a polymer.

L'efficiente veicolazione di materiale genetico in cellule viventi da parte di vettori non virali, un processo chiamato trasfezione, sta guadagnando sempre più attenzione per la loro sicurezza, in termini di effetti citotossici e immunogenici, e per la loro capacità di trasporto. Lo scopo di questo lavoro di tesi è duplice: i) da un lato, abbiamo valutato le prestazioni di un polimero cationico piuttosto nuovo, ovvero la destrina quaternizzata (QD), sintetizzata dal team del Prof. Jaiswal presso l'Indian Institute of Mandi, come vettore di trasporto genico; ii) dall'altro, abbiamo studiato il ruolo dei diversi gruppi amminici dei polimeri cationici circa la complessazione degli acidi nucleici e l'efficienza di trasfezione. I test di caratterizzazione dei complessi a base di QD hanno sottolineato la loro instabilità quando risospesi in diversi terreni di coltura tipicamente utilizzati negli esperimenti di trasfezione, in quanto destabilizzati dalle proteine del siero. Ciò è risultato in netto contrasto con quanto riportato in letteratura. A seguito di questa discrepanza, abbiamo cercato di fare più luce su questa instabilità, quindi abbiamo indagato se il gruppo amminico quaternario della QD influenzasse la capacità di complessazione e la stabilità di legame tra ammine del polimero e fosfati dell’acido nucleico. Per far ciò abbiamo indagato se ci fossero differenze nella forza di interazione tra i vari gruppi amminici che possono caratterizzare un polimero cationico e gli acidi nucleici. Abbiamo quindi valutato la stabilità dei diversi complessi attraverso saggi di fluorescenza e utilizzando un saggio di nuova concezione che si basa sull'influenza della temperatura sui legami dei poliplessi. Questo ci ha permesso di acquisire nuove conoscenze sulla loro stabilità, che non dipende strettamente dal tipo di ammina del polimero, ma piuttosto dalla natura del polimero stesso. In generale, l'efficienza di un determinato vettore polimerico non virale non si basa solo sulla sua cationicità, ma la forza di legame tra le ammine e i fosfati gioca un ruolo fondamentale sulle prestazioni complessive di un polimero.