Characterization and validation of a 3D Cholangiocarcinoma-on-chip model as a reliable in vitro platform for drug screening and cell-immune system studies

Cholangiocarcinoma (CCA) is a primary liver tumour that arise from the malignant transformation of cholangiocytes, that line the biliary tree. It is characterized by a high mortality rate and limited therapeutic options. Therefore, great efforts are urgently needed to better understand CCA pathophysiological mechanisms to develop new effective therapeutic strategies. Recently, Organ-on-chip (OoC) models were employed in cancer research since they are potentially able to recapitulate in vitro the tumour microenvironment (TME). The aim of this thesis was to deeper characterize an established CCA-on-chip model to assess its biological relevance as a reliable tool for drug screening and cell-immune system studies. Microfluidic devices were designed and fabricated at Politecnico di Milano (MI), whereas biological experiments were carried out at Humanitas Clinical and Research Center (Rozzano, MI). The model consists in a PDMS chip with three interconnected channels, with the central one hosting a co-culture of primary CCA cells and cancer associated fibroblasts (CAFs), isolated from the same patients, embedded in a collagen-fibrin hydrogel, laterally flanked by an endothelial tubule. Previous results showed that the cell-laden configuration underwent huge modifications during time in culture. In such scenario, we observed that an intense crosstalk between CCA cells and CAFs was established in this platform, leading to a massive extracellular matrix (ECM) proteins deposition, suggesting the ability of this CCA-on-chip to functionally mimic the in vivo TME. Scanning electron microscopy (SEM) and quantitative real time PCR (qRT-PCR) analysis showed a significant reduction in the pore size of the ECM during time in culture, reflected in an increased expression of several ECM proteins. These results were corroborated by an immunofluorescence staining for Collagen IV, which further highlighted that the increased release of collagen IV was remarkable only when CCA cells and CAFs were co-cultured within the chip. Drug treatments were performed on the CCA-on-chip platform using Gemcitabine and Cisplatin, the standard of care for CCA patients. COMSOL simulations allowed to investigate the drugs diffusion within the platform and were used to optimize the protocol of drug injection on-chip. Drug exposure analysis showed an increased drug resistance, resulting in a higher cell viability, in the 3D co-culture with CAFs compared to other culture conditions. These results suggested that this platform could be an innovative tool for drug-testing analysis. Furthermore, the model was integrated with the injection of T cells in the endothelial channel for cell-immune system studies. T cells migration assays were performed following an optimized protocol that avoided T cells precipitation, facilitated their adhesion and extravasation. Indeed, IMARIS reconstructions allowed to visualize that T cells adhered and migrated for the entire height of the channels. Subsequently, T cells migration was tested in different conditions, highlighting the importance of T cells activation and of an in vivo-like biochemical environment to observe the spreading of the T cells from the vessel to the tumor niche within the chip. Moreover, T cells migration was found to be higher in the 3D monoculture of CCA cells whereas was lower when in presence of CAFs, with a different T cells disposition within the tumor niche, as demonstrated by IMARIS reconstructions. qRT-PCR analysis also revealed a higher expression of T cells attractive chemokines in the 3D monoculture whereas immunosuppressive chemokines expression was higher in the 3D co-culture with CAFs. In conclusion, our results showed that CCA-on-chip model was able to faithfully mimic the TME and the interactions within it, thus resulting in a reliable tool for drug-screening analysis and in vitro cell-immune system studies.

Il colangiocarcinoma (CCA) è un tumore primario del fegato che origina dalla trasformazione maligna dei colangiociti, che rivestono i dotti biliari. È caratterizzato da un alto tasso di mortalità e opzioni terapeutiche limitate. Pertanto, sono necessari grandi sforzi per meglio comprendere i meccanismi fisiopatologici del CCA per poter sviluppare nuove strategie terapeutiche efficaci. Recentemente, i modelli Organ-on-chip (OoC) sono stati impiegati nella ricerca sul cancro poiché sono potenzialmente in grado di ricapitolare in vitro il microambiente tumorale (TME). Lo scopo di questa tesi era quello di caratterizzare più a fondo un modello CCA-on-chip già consolidato per valutarne la rilevanza biologica come strumento affidabile per lo screening di farmaci e per studi sulle interazioni tra tumore e sistema immunitario. I dispositivi microfluidici sono stati progettati e fabbricati presso il Politecnico di Milano (MI), mentre gli esperimenti biologici sono stati condotti presso l’Istituto Clinico e di Ricerca Humanitas (Rozzano, MI). Il modello consiste in un chip in PDMS con tre canali interconnessi, con quello centrale che ospita una co-coltura di cellule primarie di CCA e fibroblasti associati al tumore (CAF), isolati dagli stessi pazienti, incorporati in un gel di collagene-fibrina, fiancheggiato lateralmente da un tubulo endoteliale. I risultati precedenti hanno mostrato che il gel seminato con le cellule subisce profonde modifiche durante il tempo in coltura. In tale scenario, abbiamo osservato che in questa piattaforma è stata stabilita un'intensa interazione tra le cellule di CCA e i CAF, portando a una massiva deposizione di proteine della matrice extracellulare (ECM) e suggerendo quindi la capacità di questo modello di CCA-on-chip di imitare funzionalmente il TME in vivo. La microscopia a scansione elettronica (SEM) e l'analisi PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) hanno mostrato una significativa diminuzione della dimensione dei pori della ECM durante il tempo in coltura, che si riflette in una maggiore espressione di diverse proteine della ECM. Questi risultati sono stati confermati da una analisi del collagene IV con immunofluorescenza, che ha ulteriormente evidenziato che l'aumento di rilascio del collagene IV era notevole solo quando le cellule di CCA e i CAF erano co-coltivate all'interno del chip. I trattamenti farmacologici sono stati eseguiti sul modello di CCA-on-chip utilizzando gemcitabina e cisplatino, lo standard di cura per i pazienti con CCA. Le simulazioni COMSOL hanno permesso di studiare la diffusione dei farmaci all'interno della piattaforma e sono state utilizzate per ottimizzare il protocollo di iniezione dei farmaci su chip. Le analisi dopo il trattamento con i farmaci hanno mostrato una maggiore farmacoresistenza, con conseguente maggiore vitalità cellulare, nella co-coltura 3D con i CAF rispetto ad altre condizioni di coltura. Questi risultati hanno suggerito che questa piattaforma potrebbe essere uno strumento innovativo per lo screening di farmaci per il CCA. Inoltre, il modello è stato integrato con l'iniezione di linfociti T nel canale endoteliale, per studi sulle interazioni tra le cellule e il sistema immunitario. I saggi di migrazione delle cellule T sono stati eseguiti seguendo un protocollo ottimizzato che ha evitato la precipitazione delle cellule T, facilitato la loro adesione ed extravasazione. Infatti, le ricostruzioni con IMARIS hanno permesso di vedere come le cellule T aderivano e migravano per l'intera altezza dei canali. Successivamente, la migrazione dei linfociti T è stata testata in diverse condizioni, evidenziando l'importanza della loro attivazione e di un ambiente biochimico simile a quello in vivo per poterne osservare la diffusione dal vaso endoteliale alla nicchia tumorale all'interno del chip. Inoltre, la migrazione delle cellule T è risultata maggiore nella monocoltura 3D delle cellule di CCA mentre era inferiore in presenza di CAF, con una diversa disposizione delle cellule T all'interno della nicchia tumorale, come dimostrato dalle ricostruzioni IMARIS. L'analisi qRT-PCR ha anche rivelato una maggiore espressione di chemochine attrattive per le cellule T nella monocoltura 3D, mentre l'espressione di chemochine con azione immunosoppressiva era più elevata nella co-coltura 3D con CAF. In conclusione, i nostri risultati hanno mostrato che il modello CCA-on-chip è stato in grado di imitare fedelmente il TME e le interazioni al suo interno, risultando così in uno strumento affidabile per lo screening di farmaci e per studi in vitro sulle interazioni tra sistema immunitario e tumore.