Antioxidant TEMPO derivatives and polymers with imaging and gene-delivery perspectives

The nitroxyl radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, commonly named TEMPO, has been employed in the industry as a catalyst for decades, thanks to its ability to undergo redox reactions. This peculiarity can be exploited in a number of other different applica- tions, as in magnetic resonance imaging (MRI) as an organic contrast agent and as a spin probe. Moreover, TEMPO has been proven to be useful as an antioxidant in biological systems, providing anti-inflammatory and cytoprotective effects. In this work, TEMPO was modified to form novel linkers and grafted to polymers in order to create nanoparticles able to exploit the radical’s properties in biomedical applications. The chosen polymers in this work were polyethylene glycol (PEG) and polyethyleneimine (PEI), since they have already proven to be effective and reliable, with the possibility of varying their grafting degree. Additionally, branched PEI (b-PEI) is recognised as the "golden standard" for the production of non-viral gene delivery carriers, as it is able to form self-assembling poly- plexes with nucleic acids (NAs), and deliver efficiently exogenous genetic material in cells. Nonetheless, intrinsic cytotoxicity of b-PEI requires the formulation of new products able to mitigate this effect while maintaining optimal loading efficiency (N/P ratio). Here, TEMPO has been thus grafted on both linear and branched PEI with different degrees of functionalisation, in order to study a dose-response correlation and the cytoprotective role of the radical in stressed cells. The modified materials were then submitted to characterisation analyseis , whereas grafted PEI was tested for cytotoxicity with HeLa cell lines. PEG-PEI-TEMPO nanogels were also synthesised via an emulsion-evaporation method with the aim of further imaging studies. Results show that 2-bromo-TEMPO-acetamide is the linker with the best performances in terms of reproducibility, synthesis stability and yield, with optimal grafting ability. Additionally, the synthesised PEI-TEMPO structures were proven cytocompatible and could be thus studied as carriers for non-viral gene de- livery, while nanogels-TEMPO could become possible theragnostic devices due to their proven capabilities for drug delivery with added response to MRI.

Il radicale nitrosile 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, comunemente chiamato TEMPO, è utilizzato nell’industria come catalizzatore da decenni, grazie alla sua abilità di parteci- pare nelle reazioni redox. Questa peculiarità può essere sfruttata anche in numerosi altri ambiti come la risonanza magnetica (MRI) per ottenere agenti di contrasto e sonde di spin. Inoltre, il TEMPO è noto per le sue proprietà antiossidanti nei sistemi biologici, in quanto garantisce effetti anti-infiammatori e citoprotettivi. In questo lavoro, il TEMPO è stato modificato per formare linker innovativi e successivamente legato a polimeri per la creazione di nanoparticelle in supporto alle proprietà del radicale per applicazioni biomed- icali. I polimeri scelti sono stati il polyetilen glicole (PEG) e la polyetilen immina (PEI), poichè sono notoriamente efficaci e affidabili, con la possibilità di modificarne il grado di grafting. Inoltre, la polietilen immina ramificata (b-PEI) è riconosciuta come il "golden standard" per la produzione di vettori non virali di geni, in quanto è in grado di creare poliplessi auto-assemblanti con gli acidi nucleici (NAs) e trasportare efficentemente mate- riale genetico esogeno nelle cellule. Nonostante ciò, è necessario formulare nuovi prodotti per mitigare la citotossicità intrinseca del PEI, pur mantenendone l’ottima efficenza di loading (valore N/P). Il TEMPO è stato quindi graftato su PEI lineari e ramificati con diversi gradi di funzionalizzazione, di modo da studiare una correlazione dose-risposta e il suo ruolo citoprotettivo in cellule sotto stress. I materiali modificati sono stati carat- terizzati, e il PEI-TEMPO è stato testato per la citotossicità con linee cellulari HeLa. Sono stati sintetizzati anche nanogel PEG-PEI-TEMPO per futuri studi di imaging. I risultati ottenuti mostrano come il linker 2-bromo-TEMPO-acetammide sia quello con le migliori performance in termini di riproducibilità, stabilità della sintesi e resa, con ottime proprietà di grafting. Inoltre, le strutture PEI-TEMPO si sono rivelate citocompatibili, e potranno quindi essere studiate come vettori non virali per la terapia genica, mentre i nanogel potrebbero essere impiegati nella teragnostica grazie alle loro comprovate abilità del drug delivery con aggiunta la responsività alla risonanza magnetica.