Label-free and high-speed biomedical imaging through colocalized SHG and broadband CARS microscopy

Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy is a label-free vibrational imaging technique for delivering chemical maps of cells and tissues. Spontaneous Raman (SR), the gold standard for vibrational spectroscopy, offers high chemical specificity but suffers from low scattering cross-section, hampering imaging speed. CARS overcomes this limitation by exploiting the third-order non-linear optical response of the sample. In its basic form, CARS employs synchronized picosecond laser pulse trains (pump and Stokes) focused on the sample plane. Matching the frequency difference between the two beams to a vibrational mode of the sample coherently excites molecules, and a second interaction with the pump generates a stronger anti-Stokes signal compared to SR. However, this configuration reveals only one vibrational mode at a time. Broadband CARS (BCARS) addresses this by combining narrowband pump pulses with broadband Stokes pulses, enabling the recording of broad vibrational spectra. This combines the acquisition speed of single-frequency CARS with the chemical specificity of SR. Another technique is Second Harmonic Generation (SHG) microscopy, in which two photons are transformed into a frequency exactly twice the incident frequency. This technique is primarily employed for visualizing structures rich in collagen. \\ The thesis focuses on utilizing and improving a BCARS setup to convert it into a versatile multimodal microscope. Chapter 1 elaborates on CARS and SHG microscopy derivations. Chapter 2 describes the BCARS setup used for my thesis, discussing the improvements that I implemented to transform it into a multimodal microscope capable of simultaneously acquiring BCARS and SHG signals. Chapter 3 examines the acquisition and post-processing pipeline for CARS spectroscopy and imaging. Chapter 4 presents experimental outcomes. I first analyze solvents and subcellular components spectra. Then, I employ PCA on various tumor cell lines and I make BCARS imaging on a NASH liver slice. Lastly, I exhibit microcalcification images in breast tissue, obtained via simultaneous BCARS and SHG acquisition, highlighting the potential of my multimodal microscope.

La microscopia Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) è una tecnica di imaging vibrazionale senza etichettatura per la mappatura chimica di cellule e tessuti. La Spettroscopia Raman Spontaneo (SR), standard per la spettroscopia vibrazionale, ha alta specificità chimica ma bassa sezione d'urto di scattering e bassa velocità di acquisizione. Il CARS sfrutta la risposta ottica non lineare di terzo ordine del campione, superando questa limitazione. Nel caso base, il CARS utilizza impulsi laser al picosecondo sincronizzati (pompa e Stokes) focalizzati sul campione. Quando la differenza di frequenza tra i due fasci coincide con un modo vibrazionale del campione, le molecole vengono eccitate in modo coerente, generando un segnale anti-Stokes più forte rispetto a quello ottenuto con il SR. Tuttavia, questa configurazione rivela solo un modo vibrazionale alla volta. Il CARS a banda larga (BCARS) affronta questo limite combinando impulsi di pompa a banda stretta con impulsi di Stokes a banda larga, permettendo la registrazione di ampi spettri vibrazionali, unendo la velocità di acquisizione del CARS a singola frequenza con la specificità chimica del SR.\\ Un'altra tecnica è la microscopia SHG, in cui due fotoni si convertono in una frequenza doppia rispetto a quella incidente, utilizzata principalmente per visualizzare strutture ricche di collagene.\\ La tesi si focalizza sull’utilizzo e sull'ottimizzazione di un setup BCARS per creare un microscopio multimodale. Il Capitolo 1 introduce i principi della microscopia CARS e SHG. Il Capitolo 2 descrive il setup utilizzato, discutendo le modifiche apportate per l'acquisizione simultanea di segnali BCARS e SHG. Il Capitolo 3 esamina il processo di acquisizione e di post-processing per l’analisi dei dati CARS. Il Capitolo 4 presenta i risultati sperimentali, inclusa l'analisi degli spettri dei solventi e dei componenti subcellulari, l'applicazione della PCA a diverse linee cellulari tumorali, immagini BCARS su sezioni di fegato affetto da NASH e immagini di microcalcificazioni nel tessuto mammario ottenute tramite acquisizione simultanea di segnali BCARS e SHG, mettendo in luce il potenziale del microscopio multimodale.