Development of dual-drug loaded PLGA nanoparticles for the treatment of metastatic melanoma

The field of metastatic melanoma treatment has seen tremendous improvement in recent years, but there are still unresolved issues in current therapy with respect to the targeting of non−responsive or relapsing patients. In this regard, a recent in vivo screening demonstrated the synergistic potency of two anticancer drugs, Alisertib and Trametinib, able additively of reducing tumor growth and cell migration while prolonging mice survival in a wide panel of metastatic melanoma Patient Derived Xenografts (PDXs). To further boost effective drug delivery at the tumor site, preventing cytotoxic side effects, polymeric nanoparticles have been receiving growing interest as means of drug delivery. This thesis work sets as its aim the optimization of a nanoprecipitation protocol to efficiently encapsulate said drug inhibitors and take advantage of the Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect, passively targeting tumor tissues. In particular, PVA−coated PLGA nanoparticles (NP) were chosen, according to literature, because of their easy size and biodegradability manipulation, and a first part of the present work was dedicated to the optimization of the parameters on which nanoprecipitation is based (polymer concen- trations), in order to produce NPs with suitable size and biological medium stability. All formulations were characterised by Dynamic Light Scattering (DLS), Nanoparticle Track- ing Analysis (NTA) and Z Potential, to assess their dimensions, concentration, stability over time and electrostatic Z Potential. Optimization efforts, on average, led to NPs with a size of 115−120 nm and a concentration of 1.55E+12 NPs/ml. Because of future in vivo experiment requirements, a protocol for the attainment of an increased NP concentration was developed, and by means of filtration and pressure−controlled evaporation an increase in NPs/ml of roughly 3.5 times was achieved. Empty, fluorescent and loaded NPs were produced and incubated in vitro with different patient derived melanoma cells. Empty NPs were proven to be non−toxic for melanoma cells, and cellular uptake dynamics were evaluated. In particular, fluorescent analysis demonstrated how NPs are internalized after 3/4 hours of incubation in different cell lines. As a further perspective, in vivo experiments aimed at studying the biodistribution of PVA−coated PLGA NPs are still ongoing. Moreover, the simultaneous encapsulation of the both drug inhibitors within the same NP could provide a further benefit to therapeutic outcomes, and in vitro experiments are planned to assess the IC50 behavior of such optimized NPs. During the course of this project, co−loaded NPs containing both Alisertib and Trametinib were formulated and characterized, displaying a size and stability analogous to those of empty and single−loaded NPs. A matricial calculus was then devised in order to verify the additive nature of the Lambert−Beer law in situations of simultaneous presence of both drugs, resulting in a statistical error of 7.5% at most.

Il settore della terapia oncologica, ed in particolare quella riguardante il melanoma, ha visto enormi miglioramenti negli ultimi anni, ma ci sono ancora questioni irrisolte per quanto riguarda il target dei pazienti non responsivi o situazioni di recidiva. A questo proposito, uno screening eseguito in vivo dalla dottoressa Luisa Lanfrancone et al. ha dimostrato come l’azione congiunta di Alisertib e Trametinib sia in grado di ridurre la crescita del tumore e a prolungare la sopravvivenza dei topi trattati in un ampio gruppo di xenotrapianti derivati da pazienti con melanoma metastatico (PDX). Per aumentare ulteriormente l’efficacia della somministrazione di farmaci nel sito tumorale, prevenendo gli effetti citotossici collaterali, le nanoparticelle polimeriche hanno ricevuto un crescente interesse come mezzo di somministrazione di farmaci. Questo lavoro di tesi ha quindi come obiettivo l’ottimizzazione di un protocollo di nanoprecipitazione per incapsulare in modo efficiente i suddetti inibitori, sfruttando l’effetto di maggiore permeabilità e ritenzione (EPR) per bersagliare passivamente i tessuti tumorali. In particolare, in accordo con la letteratura, sono state scelte nanoparticelle (NP) di PLGA rivestite di PVA, per via della facile manipolazione delle loro dimensioni e biodegradabilità, ed una prima parte del presente lavoro è stata dedicata all’ottimizzazione dei parametri su cui si basa la procedura di formulazione (le concentrazioni dei polimeri), al fine di produrre NP con dimensioni adeguate e stabilità in mezzo biologico. Tutte le formulazioni sono state dunque caratterizzate mediante Dynamic Light Scattering (DLS), Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) e potenziale Z, per valutarne le dimensioni, la concentrazione, la stabilità nel tempo e il potenziale Z elettrostatico. L’ottimizzazione, in media, ha portato a NP con dimensioni di 115−120 nm e una concentrazione di 1,55E+12 NP/ml. In vista di futuri esperimenti in vivo, è stato poi sviluppato un protocollo per ottenere una maggiore concentrazione di NP e, mediante filtrazione ed evaporazione a pressione controllata, è stato possibile ottenere un aumento delle NP/ml di circa 3.5 volte. Sono state prodotte NP vuote, fluorescenti e caricate coi farmaci, incubate poi in vitro con diverse cellule di melanoma derivate da pazienti. Le NP vuote si sono dimostrate non tossiche per le cellule di melanoma, e sono state poi valutate le dinamiche di assorbimento cellulare. In particolare, l’analisi della fluorescenza ha dimostrato come le NP venissero internalizzate dopo 3/4 ore di incubazione nelle diverse linee cellulari. Come ulteriore prospettiva, sono tuttora in corso esperimenti volti a studiare la biodistribuzione delle NP PLGA rivestite di PVA. Inoltre, l’incapsulamento simultaneo di entrambi i farmaci inibitori all’interno della stessa NP potrebbe fornire un ulteriore vantaggio ai risultati terapeutici, e sono previsti esperimenti in vitro per valutare il comportamento IC50 di tali NP ottimizzate. Nel corso di questo progetto, sono state formulate e caratterizzate NP co−caricate contenenti sia Alisertib che Trametinib, che hanno mostrato dimensioni e stabilità analoghe a quelle delle NP vuote e caricate singolarmente con uno o l’altro farmaco. È stato quindi ideato un calcolo matriciale per verificare la natura additiva della legge di Lambert−Beer in situazioni di presenza simultanea di entrambi i farmaci, ottenendo un errore statistico del 7.5% al massimo.